乳制品中選擇性分離與計數植物乳桿菌的方法

張耀廣，李興佳，屈雅莉，柴艷兵，李飛，趙媛媛，楊春杰

(君樂寶乳業集團，河北 石家莊，050000)

植物乳桿菌作為具有保健意義的功能性益生菌，不僅可以有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、短小芽孢桿菌、單增李斯特菌的生長繁殖[1-5]，還能通過抑制腸道細菌的移位，抑制過度炎性反應，改善人體腸道菌群，參與調控腸道內穩[6-8]。植物乳桿菌不僅可以通過菌體細胞吸收膽固醇，降低人體內膽固醇的含量[9]，還能降解發酵過程中產生的亞硝酸鹽，緩解鉛毒性[10-13]，使發酵食品中的亞硝酸鹽風險降低。基于以上優勢，植物乳桿菌在功能性酸奶、發酵豆乳、干酪、功能性乳酸菌飲料等發酵乳制品中得到廣泛應用[7,14-15]。

基于特異性引物的PCR技術已被應用于植物乳桿菌的檢測[16-20]。但該種方法要求專業水平極高，不適用于生產企業的檢測及推廣。目前國內外有一些用于酸奶中常見益生菌計數和研究的選擇性或鑒別性培養基[21-23]，但這些培養基只能將常用的菌種(雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌)分離開來，對于與植物乳桿菌親緣關系極近的干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的分離計數，還未見相關研究報道。

無論是國內還是國際，對植物乳桿菌食品質量的監管和認證，尤其在定性、定量檢測方面缺乏科學、合理、快速的方法。因此，建立和健全發酵乳制品中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的分離與計數方法，對于我國發酵乳制品中植物乳桿菌檢測及產品質量的把關，具有重要的實際意義。

本研究通過對MRS培養基中碳源的改良與優化、對抗生素的敏感度及產酸能力的研究，根據植物乳桿菌的生長特性，研制出植物乳桿菌分離計數培養基(LP-MRS培養基)，得到能夠對發酵乳制品中植物乳桿菌的分離和計數培養基，建立一種操作簡便、特異性強的植物乳桿菌分離計數方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophiles(CICC 6038)、瑞士乳桿菌Lactobacillushelveticus(CICC 6032)、嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus(CICC 6069)、干酪乳桿菌Lactobacilluscasei(CICC 6117)、植物乳酸桿菌Lactobacillusplantarum(CGMCC NO.1258)購自中國工業微生物保藏管理中心;乳酸乳球菌乳酸亞種Lactococcuslactissubsp.lactis(JLB-1105)、嬰兒雙歧桿菌Bifidobacterium(La-14)、鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosus(LR1)、副干酪乳桿菌Lactobacillusparacasei(N1115)由實驗室分離鑒定并保存。

1.2 培養基

植物乳桿菌分離計數培養基(LP-MRS培養基)：蛋白胨(10.0 g/L)、酵母粉(4.0 g/L)、吐溫80 (1.0 mL/L)、K2HPO4·7H2O(2.0 g/L)、乙酸鈉(3H2O)(5.0 g/L)、檸檬酸三銨(2.0 g/L)、MgSO4·7H2O(0.2 g/L)、MnSO4·4H2O(0.05 g/L)、麥芽糖(10 g/L)、瓊脂(15.0 g/L)。

用法：按照上述配方稱取各成分，溶解于1 L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調整pH值至6.0±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min，待冷卻至50 ℃，每100 mL基礎培養基中無菌加入P-08B萬古霉素1支，同時加入300 μL 1.6 g/L溴甲酚紫(乙醇溶解)，混勻后傾注平板備用。

MRS瓊脂培養基、MRS液體培養基。

1.3 LP-MRS培養基對單菌株選擇性效果試驗

將9株活化后的菌株分別在LP-MRS平板培養基上劃線，同時在MRS平板上劃線，作為活力對照，36±1 ℃厭氧培養72±2 h后，觀察菌株生長情況及菌落形態。

1.4 LP-MRS培養基對混合菌株選擇性效果試驗

從MRS平板上挑取純菌落于生理鹽水中，制備成108CFU/mL的菌懸液，將植物乳桿菌與乳酸乳球菌乳酸亞種、嗜熱鏈球菌、瑞氏乳桿菌、嗜酸鏈球菌、嬰兒雙歧桿菌混合，作為第1組試驗樣品，將植物乳桿菌與乳酸乳球菌乳酸亞種、嗜熱鏈球菌、瑞氏乳桿菌、嗜酸鏈球菌、嬰兒雙歧桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌混合，作為第2組試驗樣品。

將以上2組試驗樣品按照1∶9進行稀釋，得到10倍系列稀釋液。選取2～3個合適的稀釋度，分別取0.1 mL稀釋液，加入到LP-MRS平板上，用涂布棒涂布均勻后，36±1 ℃倒置厭氧培養72±2 h，觀察菌落形態。

1.5 LP-MRS培養基對植物乳桿菌計數的影響

將植物乳桿菌菌懸液進行10倍稀釋，選取合適的稀釋度分別在2塊MRS平板上和2塊LP-MRS平板上進行涂布，涂布均勻后，36±1 ℃倒置厭氧培養72±2 h，按照GB 4789.35—2016中計數方式進行計數。每種培養基進行5個重復，計算相對誤差。

1.6 乳制品中植物乳桿菌的分離計數

以無菌操作稱取25 g樣品，置于裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶內，置于渦旋混勻器上振蕩2 min，制成1∶10樣品勻液。用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液)，振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。另取1 mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋1次，即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。

根據待檢樣品活菌總數的估計，選擇2～3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1 mL樣品勻液分別置于2個MRS和LP-MRS瓊脂平板，使用L形棒進行表面涂布。36±1 ℃厭氧培養72±2 h后計數平板上的典型菌落數。從樣品稀釋到平板涂布要求在15 min內完成。選取菌落數在30～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。

2 結果與分析

2.1 LP-MRS培養基對單菌株選擇性效果試驗

結果表明，乳酸乳球菌乳酸亞種、嗜熱鏈球菌、瑞氏乳桿菌、嗜酸鏈球菌、嬰兒雙歧桿菌在LP-MRS平板上受到抑制，均無生長；鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌在平皿上不受抑制，均能生長(見圖1)。

培養72 h后，副干酪乳桿菌在LP-MRS培養基平板上菌落為乳黃色，圓形，邊緣整齊，直徑1～2 mm大小，周圍培養基變黃；干酪乳桿菌菌落白色，圓形，邊緣不整齊，直徑0.5～1 mm大小，周圍培養基顏色不變，為藍紫色；鼠李糖乳桿菌菌落白色，圓形，邊緣整齊，直徑1～2 mm大小，周圍培養基顏色不變；植物乳桿菌菌落呈“煎蛋狀”，有黃色實心，周圍有乳圈，圓形，邊緣整齊，直徑2～3 mm大小，培養基顏色由藍紫色變成黃色。

2.2 LP-MRS培養基對混合菌株選擇性效果實驗

植物乳桿菌與乳酸乳球菌乳酸亞種、嗜熱鏈球菌、瑞氏乳桿菌、嗜酸鏈球菌、嬰兒雙歧桿菌混合培養72 h后，LP-MRS平板上只有植物乳桿菌生長，菌落呈“煎蛋狀”，黃色實心，周圍有乳圈，圓形，邊緣整齊，直徑2～3 mm大小，培養基顏色由藍紫色變成黃色(圖2上)。

植物乳桿菌與乳酸乳球菌乳酸亞種、嗜熱鏈球菌、瑞氏乳桿菌、嗜酸鏈球菌、嬰兒雙歧桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌混合培養72 h后，LP-MRS平板上有植物乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌生長，但植物乳桿菌在培養基上呈現特有的菌落特征：菌落黃色實心，周圍有乳圈，圓形，邊緣整齊，直徑2～3 mm大小，培養基顏色由藍紫色變成黃色，其他菌落無“煎蛋狀”特征，因此，可以將植物乳桿菌從中分離開來，且不同濃度下，植物乳桿菌均易于辨識(圖2下)。

1-嗜酸鏈球菌；2-瑞氏乳桿菌；3-嬰兒雙歧桿菌；4-嗜熱鏈球菌；5-乳酸乳球菌乳酸亞種；6-鼠李糖乳桿菌；7-植物乳桿菌；8-干酪乳桿菌；9-副干酪乳桿菌;左：MRS；右：LP-MRS圖1 不同乳酸菌在MRS和LP-MRS上生長情況Fig.1 The growth in the MRS medium and LP-MRS medium of different lactic acid bacteria

上：第1組；下：第2組圖2 植物乳桿菌的分離Fig.2 The isolation of Lactobacillus plantarum

結果表明，LP-MRS培養基可用于含乳酸乳球菌乳酸亞種、嗜熱鏈球菌、瑞氏乳桿菌、嗜酸鏈球菌、嬰兒雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌混合菌株樣品中的植物乳桿菌的分離。

2.3 LP-MRS培養基對植物乳桿菌計數的影響

表1 植物乳桿菌在MRS和LP-MRS上數量 成組法T檢驗分析Table 1 Group T test analysis of Lactobacillus plantarum on MRS medium and LP-MRS medium

由表1可知，用成組法T檢驗分析MRS平板和LP-MRS平板進行植物乳桿菌的菌落計數，兩者沒有顯著性差異(p=0.783 4)。結果表明，LP-MRS培養基中的營養成分和萬古霉素對植物乳桿菌的計數沒有影響，該培養基可用于植物乳桿菌的計數。

2.4 乳制品中植物乳桿菌的分離計數

結果表明(表2)，植物乳桿菌與常用的益生菌混合發酵后，無論是發酵乳、活菌型乳酸菌飲料，還是固體菌種，均能用LP-MRS培養基檢測植物乳桿菌的數量。LP-MRS培養基可以滿足市售乳制品中植物乳桿菌的檢測與計數需求。

3 討論

越來越多的乳制品應用植物乳桿菌作為添加菌種，但對于植物乳桿菌的檢測與計數方法研究甚少。因此，建立乳制品中植物乳桿菌的檢測和計數方法，已成為當務之急。

隨著分子生物技術的發展，實時熒光PCR技術已在微生物定性及定量研究中得到廣泛應用。陳臣通過熒光定量PCR技術，以RNA反轉錄的cDNA為模板，建立植物乳桿菌的定性及定量檢測方法，但該方法的檢出限為2.26×102CFU/mL[17,19]，且RNA易降解，對人員技術要求極高，實際應用中具有一定的難度。孫凱等利用DPO引物，結合SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR技術，建立植物乳桿菌的檢測方法，但該方法只能對樣品中的DNA含量進行定量，無法對樣本中的菌落數進行分析[20]。且對于生產企業而言，分子生物方法成本高，對人員要求嚴格，很難在企業中得到推廣應用。

表2 乳制品中植物乳桿菌的分離計數Table 2 Enumeration of Lactobacillus plantarum separated from dairy products

部分學者利用山梨醇-MRS培養基進行植物乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌中植物乳桿菌的計數，但對于與植物乳桿菌相似的干酪乳桿菌群來說，該方法不能將植物乳桿菌分離開來[24]。

本研究基于植物乳桿菌產酸能力及對抗生素敏感程度不同，建立了植物乳桿菌的檢測和計數方法。該方法通過不同菌株對萬古霉素的敏感性，將植物乳桿菌與乳酸乳球菌乳酸亞種、嗜熱鏈球菌、瑞氏乳桿菌、嗜酸鏈球菌、嬰兒雙歧桿菌區分開來，利用植物乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌產酸能力及麥芽糖利用不同，將植物乳桿菌分離。通過比較植物乳桿菌在LP-MRS培養基和MRS培養基中的計數結果，表明該培養基對植物乳桿菌計數無影響，可以用于植物乳桿菌的計數。對12份不同的乳制品進行植物乳桿菌計數，表明該方法適用于乳制品中植物乳桿菌的分離計數。該方法操作方便、成本低、對人員要求低，檢測程序與乳酸菌總數的國家標準流程一致，適用于乳制品企業對產品中植物乳桿菌的檢測和計數，可得到廣泛的推廣應用。