白酒難揮發(fā)組分中呈苦味三羥基十八烯酸的分離與鑒定

趙騰飛，陳雙，李華鐘，徐巖

(江南大學，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，生物工程學院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇 無錫 214122)

白酒是我國獨具民族特色的蒸餾酒，其固態(tài)蒸餾的生產(chǎn)工藝不僅賦予白酒復(fù)雜的揮發(fā)性組分[1]，同時也能夠?qū)⒕契蟹肿恿枯^大的難揮發(fā)組分夾帶至酒體中[2-3]。豐富的揮發(fā)性組分和難揮發(fā)組分共同構(gòu)成了白酒的獨特風味。

早期對白酒中化學成分的研究主要集中于揮發(fā)性組分的解析，通過氣相色譜-質(zhì)譜和全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜等技術(shù)的應(yīng)用，在白酒中已鑒定出超過1 000種揮發(fā)性組分[4]。而基于氣相色譜-聞香技術(shù)的應(yīng)用，進一步明晰了這些揮發(fā)性組分在白酒中的風味功能。目前已在不同香型白酒中鑒定出超過400種具有香氣功能的化合物，基本解析了不同香型白酒的關(guān)鍵風味特征[5-7]。隨著研究的深入，對白酒的探索逐漸從揮發(fā)性組分擴展至難揮發(fā)組分。鄭偉等人通過衍生化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜首次分析了醬香、濃香和清香三大香型酒樣的難揮發(fā)化合物，共鑒定出16種醇、23種有機酸、16種酯和9種糖等化合物，并指出醬香型酒樣的難揮發(fā)組分最為復(fù)雜。但在該研究中，仍有大量色譜峰未能準確定性[3]。楊會等人同樣使用衍生化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜的方法針對白酒中的難揮發(fā)有機酸進行了分析，共定性定量了27種有機酸[8]。張榮等人通過制備液相色譜結(jié)合核磁共振技術(shù)，首次在白酒中分離鑒定出分子質(zhì)量>1 000 u的脂肽類化合物[2]。這些研究表明白酒中存在豐富的難揮發(fā)組分，但由于難揮發(fā)組分中化合物的多樣性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，對難揮發(fā)化合物的分離鑒定及風味功能研究存在很大的挑戰(zhàn)。

白酒作為嗜好性酒精飲品，味覺和口感是決定其風味質(zhì)量和消費者偏好的重要指標。一般而言，大多數(shù)呈味物質(zhì)具有難揮發(fā)性[9-10]，然而在白酒難揮發(fā)組分中，有關(guān)呈味化合物的分析卻鮮有報道。針對復(fù)雜食品基質(zhì)中具有呈味功能化合物的研究，德國HOFMANN教授團隊建立了一套基于滋味稀釋技術(shù)的分析方法(taste dilution analysis，TDA)[11]，它能準確且高效地鑒定食品中的關(guān)鍵呈味物質(zhì)。TDA方法主要原理是以人們的口腔感知為導(dǎo)向，結(jié)合高效液相色譜、凝膠色譜和高速逆流色譜等分離技術(shù)，從食品呈味組分中分離出關(guān)鍵呈味化合物，進一步通過傅里葉紅外光譜、高分辨質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)對關(guān)鍵呈味化合物的結(jié)構(gòu)進行鑒定。該方法已經(jīng)成功的鑒定出啤酒中[12]、清酒中的苦味化合物[13]和葡萄酒中的酸澀味化合物[14]等。

因此本研究針對白酒基質(zhì)，基于TDA技術(shù)建立白酒難揮發(fā)組分中呈味組分的提取分離和鑒定方法，解析白酒難揮發(fā)組分中具有呈味功能的化合物，有助于豐富對白酒中呈味物質(zhì)的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

甲醇、乙醇和甲酸均為色譜純，購買于Adamas-beta(中國上海)；2-羥基丙酸(CAS：50-21-5)和2-羥基-4-甲基戊酸(CAS：498-36-2)購買于Sigma-Aldrich(中國上海)；9,10,13-三羥基-11(E)-十八烯酸(CAS：29907-57-1)和9,12,13-三羥基-10(E)-十八烯酸(CAS: 29907-56-0)購買于Larodan Fine Chemicals(瑞典)；瓶裝水(中國杭州，哇哈哈)，用于感官品評；去離子水為Milli-Q超純水，用于儀器分離。實驗中所用5%乙醇水溶液和1%甲酸水溶液中的百分數(shù)均指體積分數(shù)。

1.2 白酒樣品

醬香型白酒(醬香1，53%(vol)，由貴州某酒廠提供)，用于呈味物質(zhì)的分離鑒定。醬香型酒樣[醬香2，53%(vol)]、濃香型酒樣[濃香1、濃香2，52%(vol)]和清香型酒樣[清香1、清香2，52%(vol)]均為市售成品白酒，用于呈味物質(zhì)含量分析。所有酒樣都儲存于4 ℃以待分析。

1.3 實驗儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士，Buchi)；冷凍干燥儀(美國，Labconco Corporation，4.5 L)；液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography，日本，Shimadzu，LC-20A)；超高效液相色譜儀-三重四極桿質(zhì)譜儀(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS，美國，Waters，XEVO)；高分辨質(zhì)譜儀(high resolution mass spectrometry，HRMS，美國，Thermo Fisher，Q Exactive)；核磁共振儀(nuclear magnetic resonance，NMR，德國，Bruker，AVANCE III)。

1.4 實驗方法

1.4.1 難揮發(fā)組分的收集

使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對白酒樣品進行分離(具體使用的酒樣量分別在結(jié)果與分析中列出)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴溫度為40 ℃，真空度-0.1 MPa。當蒸發(fā)瓶中的酒樣<10 mL時，停止蒸發(fā)，收集難揮發(fā)組分。使用冷凍干燥儀器對難揮發(fā)組分進行凍干處理，將凍干后的樣品儲存于-20 ℃以待分析。

1.4.2 難揮發(fā)組分的固相萃取分離

將難揮發(fā)組分溶解至5%乙醇水溶液中，稀釋后裝載至C18固相萃取柱(柱體積60 mL，填料10 g；上海，安譜)。收集不被柱子保留的組分(F1)，被柱子保留的組分依次使用20%、40%、60%、80%和100%的甲醇水溶液進行洗脫，收集相對應(yīng)的組分(F2～F6)。所有組分進行去溶劑凍干處理，并儲存于-20 ℃以待分析。

1.4.3 HPLC分離

將得到的組分F4溶解于甲醇，組分F1溶解于水溶液。使用HPLC分別對它們進行分離。流動相為1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速為2 mL/min，紫外吸收波長225 nm。組分F4的洗脫梯度：Water C18色譜柱(5 μm，10 mm×250 mm)，0 min，A/B(70∶30)，3 min，A/B(70∶30)，40 min，A/B(0∶100)，45 min，A/B(0∶100)。組分F1的洗脫梯度：Waters苯基色譜柱(5 μm，10 mm×250 mm)，0 min，A/B(95∶5)，10 min，A/B(95∶5)，12 min，A/B(80∶20)，15 min(80∶20)。按照色譜峰將組分F4和F1分成若干亞組分，收集這些亞組分并對其進行去溶劑和凍干處理，之后儲存于-20 ℃以待分析。

將組分F4-7溶解于甲醇，使用Waters苯基柱將組分F4-7繼續(xù)分離，流動相為含1%的甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速為2 mL/min，紫外吸收波長225 nm。洗脫梯度：0 min，A/B(55∶45)，35 min，A/B(45∶55)，40 min，A/B(0∶100)，45 min，A/B(0∶100)。按照色譜峰將組分F4-7再次分成若干亞組分，收集這些亞組分并對其進行去溶劑和凍干處理，之后儲存于-20 ℃以待分析。

1.4.4 TDA分析

具體TDA實驗方法參考文獻[11]，將2 L酒樣醬香1的難揮發(fā)組分通過HPLC分離，收集得到的組分，凍干后，溶解至2 mL 5%乙醇水溶液中，按照1∶1(體積比)的比例逐步用5%乙醇水溶液稀釋。每個組分按照稀釋倍數(shù)從高至低分配至感官品評人員進行品評，每個稀釋倍數(shù)的溶液都需要進行三點檢驗。當品評人員剛好能分辨出某個稀釋水平與其它兩個空白樣品中(5%乙醇水溶液)的差異時，則記錄此稀釋倍數(shù)為該組分的稀釋值(TD值)。每個組分的TD值取自12個品評員品評結(jié)果的平均值。每個組分的TD值的誤差不超過1個稀釋水平。

1.4.5 呈味化合物結(jié)構(gòu)鑒定

采用HRMS和NMR對通過TDA得到的關(guān)鍵呈味組分F4-7/5、F1-2和F1-3和進行分析，鑒定其中的呈味物質(zhì)。具體分析結(jié)果如下:

2-羥基丙酸(3，圖3-A2)。HRMS(ESI-)：測量值89.0232([M-H]-)，計算值C3H5O3，誤差-1.4 ppm。MS/MS(m/z%)：89.0232(40)，43.0178(100)。

2-羥基-4-甲基戊酸(4，圖3-A3)。HRMS(ESI-)：測量值131.0705([M-H]-)，計算值C6H11O3，誤差1.7 ppm；MS/MS(m/z%)：131.0701(93)，113.0595(3)，86.0678(7)，85.0645(100)，69.0331(3)。

1.4.6 呈味化合物定量分析

采用標準曲線法進行定量分析。配制化合物1和2的標準品的工作液，每個化合物配制7個質(zhì)量濃度的工作液，化合物1和2的濃度范圍是10～1 000 μg/L。使用UPLC-MS/MS測量每個質(zhì)量濃度工作液所對應(yīng)的色譜峰面積，并制作相應(yīng)的標準曲線。質(zhì)譜采用陰離子模式下的多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)進行測量。具體質(zhì)譜參數(shù)為：離子源溫度120 ℃，去溶劑溫度450 ℃，毛細管電壓0.6 kV，錐孔電壓3 V，錐孔氣流0.25 mL/min，去溶劑氣流1 100 L/h。每個濃度測量6次，計算方法精密度。在測試回收率時，將確定含量的標準化合物加入酒樣中，進行前處理后，測試濃度。具體計算方法：

取50 mL酒樣，除去揮發(fā)性組分，將剩余難揮發(fā)組分裝載至C18固相萃取柱，依次使用體積分數(shù)為20%和100%的甲醇水溶液洗脫，并收集100%甲醇洗脫下的組分。對該組分進行凍干處理。定量呈味物質(zhì)1和2的濃度時，將各組分溶解于甲醇，稀釋至標準曲線濃度范圍內(nèi)，經(jīng)過0.45 μm膜過濾后，使用UPLC-MS/MS進行分析，每個樣品測試3次。

使用BEH C18色譜柱對樣品進行分離，流動相為1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)。洗脫梯度：流速0.3 mL/min，0 min A/B(70∶30)，1 min A/B(70∶30)，10 min A/B(0∶100)，11 min A/B(70∶30)，12 min A/B(70∶30)。

1.4.7 感官品評

感官品評方法參照HOFMANN等人文獻[11]。挑選12個從事白酒品評2年以上的人員(6男、6女，年齡25～35)建立感官品評小組。為了分析難揮發(fā)酒樣中的呈味物質(zhì)，使用5種基本味覺(酸、甜、苦、咸、鮮)所對應(yīng)的標準品溶液對品評人員進行再次培訓(xùn)。感官品評采用吞吐(sip-and-spit)的品評方式，安全起見，品評人員在品評樣品后必須將樣品吐出，不允許吞咽樣品。在品評過程中，為了防止香氣化合物的影響，品評人員必須佩帶鼻夾。

味覺強度的測定：在品評酒樣醬香1難揮發(fā)組分和其固相萃取分離組分的味覺強度時，將分離后的各組分溶解于2 mL 5%乙醇水溶液中，通過吞吐法品評樣品并對其按照0(沒有味覺)～5(能強烈感知)的強度級別進行打分。最終味覺強度取自12個品評員品評結(jié)果的平均值。

1.4.8 HRMS分析

使用HRMS對經(jīng)過HPLC分離后的組分進行分析。將凍干后的呈味組分F4-7/5、F1-2和F1-3溶解2 mL甲醇中，濃度約為1 mg/L，經(jīng)過0.45 μm膜過濾后直接進樣分析。質(zhì)譜使用陰離子全掃模式，掃描質(zhì)量范圍是10～800 u，分辨率為70 000 50%峰寬。數(shù)據(jù)使用Thermo Fisher Xcalibur軟件進行分析。

1.4.9 NMR分析

使用NMR(400 MHz)對HPLC分離后的組分進行分析，溫度為30 ℃。處理10 L醬香1，得到凍干后的組分F4-7/5約4 mg。根據(jù)溶解性，將樣品溶解至500 μL CD3OD中并裝入核磁管進行檢測。檢測得到數(shù)據(jù)使用MestReNova V6.1進行分析。

1.4.10 統(tǒng)計分析

使用Excel 2013軟件對在6中酒樣中檢測得到的呈味化合物濃度進行單因素方差分析(p<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型酒樣中難揮發(fā)組分的感官特征分析

在醬香、濃香和清香3大香型白酒中，醬香型白酒的難揮發(fā)組分最為復(fù)雜[3]。因此，本研究選用醬香型酒樣進行分析。為了解析醬香型酒樣中難揮發(fā)組分的感官特征，對50 mL酒樣采用減壓蒸餾和冷凍干燥技術(shù)除去揮發(fā)性組分，對剩余的難揮發(fā)組分進行感官品評。感官分析表明難揮發(fā)組分具有明顯的苦味和酸味特征，其味覺強度分別為2.2和4.0(表1)。這2種味覺都是白酒重要的風味特征，微量苦味可以豐富白酒的風味[15]，適量酸味能夠使白酒具有醇厚感[16]。為了解析難揮發(fā)組分中的苦味和酸味物質(zhì)，以感官為導(dǎo)向，通過多級分離技術(shù)從難揮發(fā)組分中篩選出關(guān)鍵呈味組分，以進行后期結(jié)構(gòu)鑒定。具體實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程圖Fig.1 Experiment scheme of this study

首先采用C18固相萃取柱按照化合物的極性對難揮發(fā)組分進行預(yù)分離，并對得到的組分進行感官品評。結(jié)果顯示疏水性組分F4的苦味強度分別為2.0，親水性組分F1的酸味強度為3.9；其他組分的味覺強度較弱或者無明顯滋味(表1)。因此，將重點分析F4和F1這兩個組分。

注：a難揮發(fā)組分由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分離制備，F(xiàn)1～F6為通過固相萃取分離后的組分；b得率通過稱重獲得，每個值測量3次取平均值；c苦味和酸味強度的品評值由12個品評人員評定，品評范圍0(無明顯味覺)～5(強烈感知)。

2.2 苦味組分F4的二級HPLC-TDA分析

采用UPLC-MS通過離子全掃模式對組分F4和F1進行初步檢測，分析結(jié)果顯示這2個組分非常復(fù)雜。為了分析組分F4和F1中的呈味化合物，對2 L醬香1酒樣進行固相萃取分離并得到相應(yīng)的組分F4和F1，使用HPLC對這2個組分進行進一步分離，結(jié)合TDA篩選出關(guān)鍵呈味組分。

首先使用C18色譜柱分離具有苦味特征的組分F4。感官品評分離后的組分得出，F(xiàn)4-7的TD值為8，其它組分的TD值均≤1(圖2-A)。說明F4-7是難揮發(fā)組分中的主要苦味組分。但使用UPLC-MS分析后發(fā)現(xiàn)該組分仍含有多個離子，比較復(fù)雜，需要二級HPLC分離。

圖2 苦味組分F4和的二級HPLC-TDA分析(A、B)以及F4-7/5的高分辨質(zhì)譜分析(C)[9,10,13-三羥基-11(E)-十八烯酸(1)和9,12,13-三羥基-10(E)-十八烯酸(2)]Fig.2 Two-dimensional HPLC-TDA analysis of bitter-tasting fraction F4 (A,B) and HRMS analysis of fraction F4-7/5 (C)[9,10,13-trihydroxyoctadec-11(E)-enoic acid (1) and 9,12,13-trihydroxyoctadec-10(E)-enoic acid (2)]

使用苯基色譜柱對組分F4-7進行二級分離。在得到的組分中，僅有組分F4-7/5的TD值最高，其它組分雖有較強的色譜峰，但其TD均≤1(圖2-A)。再次使用UPLC-MS分析后可知該組分所含主要離子是329 [M-H]-，可進行定性分析。

使用HRMS分析苦味組分F4-7/5，結(jié)果顯示其所含離子的精確分子質(zhì)量為329.2333 [M -H]-，對應(yīng)元素組成是C18H34O5(不含陰離子)。分析該化合物的二級質(zhì)譜信息，在子離子碎片中，有連續(xù)的H2O缺失(329、311、293，圖2-C)，結(jié)合不飽和度(RDB=2)，可知該化合物可能含有羥基和羧基。通過Scifinder搜索具有這些結(jié)構(gòu)信息的化合物并進行比對[17]，初步推測該組分中的化合物是一對互為同分異構(gòu)體的三羥基十八烯酸。采用NMR技術(shù)進一步分析該化合物的結(jié)構(gòu)特征。在13C譜中，可以明確解析出一個羧基碳(δ 176.4)，3個與羥基相連的碳(δ 71.7、74.3和75.4)和1對雙鍵碳(δ 129.6 和136.3)。同樣在1H譜中也可以分辨出這些基團所對應(yīng)的氫。并且，在雙鍵dd峰中的偶合常數(shù)為J=13.2，說明該雙鍵是反式。最后，結(jié)合質(zhì)譜信息確定羥基和雙鍵的位置，并通過標準品的比對，鑒定出這一對同分異構(gòu)體為9,10,13-三羥基-11(E)-十八烯酸(1)和9,12,13-三羥基-10(E)-十八烯酸(2，圖2-A3)。文獻報道這類三羥基脂肪酸是亞油酸的氧化產(chǎn)物[18]，具有典型的苦味特征，在多種食品中被檢測到，對產(chǎn)品的風味具有重要影響[19-21]。亞油酸也是釀酒原料高粱中最主要的不飽和脂肪酸[22]，推測這類物質(zhì)可能源于高粱中亞油酸的氧化分解。

2.3 酸味組分的HPLC-TDA分析

對酸味組分F1使用苯基柱分離，感官品評分離后的組分可知，F(xiàn)1-2和F1-3有明顯的酸味，TD值分別是512和8，其他組分TD值均≤1(圖3-A)。由此說明這2個組分是關(guān)鍵呈味組分，經(jīng)過UPLC-MS分析可知組分F1-2和F1-3所含的主要離子分別是89和131 [M-H]-，可進行定性分析。

使用HRMS分析酸味組分F1-2和F1-3，結(jié)果顯示它們所含主要離子的精確分子質(zhì)量分別為89.023 2和131.070 5 [M-H]-，對應(yīng)的元素組成分別為C3H6O3和C6H12O3(不含陰離子)。從分子式的不飽和度和含氧元素的個數(shù)分析，這2個化合物應(yīng)該含有羥基和羧基。結(jié)合之前對白酒有機酸類化合物的分析[8]，推測這2種化合物分別為2-羥基丙酸(乳酸，3，圖3-B)和2-羥基-4-甲基戊酸(4，圖3-C)，再通過與標準品的比對，確定了它們的結(jié)構(gòu)。雖然，在白酒難揮發(fā)組分中有多種有機酸[8]，但本研究通過TDA證明了化合物3和4是難揮發(fā)組分中最主要的兩種呈味酸。

圖3 酸味組分F1(A)的HPLC-TDA分析以及組分F1-2(B)和F1-3(C)的高分辨質(zhì)譜分析[乳酸(3)和2-羥基-4-甲基戊酸(4)]Fig.3 HPLC-TDA analysis of sour-tasting fraction F1 (A) and HRMS analysis of fraction F1-2 (B) and F1-3 (C) [lactic acid (3) and 2-hydroxy-4-methylpentanoic acid (4)]

2.4 白酒中三羥基脂肪酸的含量分析

對在白酒中首次鑒定出的化合物1和2，采用UPLC-MS/MS技術(shù)通過MRM模式建立它們的定量方法。雖然化合物1和2互為同分異構(gòu)體，但結(jié)構(gòu)差異使它們具有不同的二級質(zhì)譜信息(圖2-C)。根據(jù)子離子碎片選擇相應(yīng)的定量離子，以實現(xiàn)對它們的分別定量分析。化合物1對應(yīng)的定量離子為m/z329→201，標準曲線參數(shù)是y=12.87x-16.06(x：μg/L)，R2=0.998；化合物2對應(yīng)的定量離子為m/z329→199，y=10.63x+15.33(x：μg/L)，R2=0.997。化合物1和2定量方法的精密度分別為5.4%和6.4%，回收率分別為93.7%和91.6%。精密度和準確性良好，可以進行定量分析。

為了分析化合物1和2的在白酒中的含量分布，選擇其他醬香、濃香和清香型的酒樣進行對比(表2)。結(jié)果顯示，化合物1和2在醬香、濃香和清香共6種酒樣中均存在，濃度范圍分別為1.8～265.3和2.2～111.3 μg/L。但它們在6種酒樣中的濃度具有顯著性差異(p<0.01)，且在醬香型白酒中質(zhì)量濃度最高，僅有化合物2在2種清香型酒樣中的濃度無顯著性差異。

表2 苦味化合物1和2a 在不同酒樣中的含量b 單位：μg/L

注：a每個編號對應(yīng)的化合物見圖2；b同列不同的大寫字母表示有顯著性差異(p<0.01)。

3 結(jié)論

本研究采用TDA技術(shù)分析白酒難揮發(fā)組分中的呈味物質(zhì)。通過以感官強度為導(dǎo)向，結(jié)合固相萃取和多級HPLC分離，從醬香型酒樣的難揮發(fā)組分中篩選并分離出關(guān)鍵呈味化合物，對其進行結(jié)構(gòu)解析。采用HRMS技術(shù)鑒定出了酸味化合物乳酸和2-羥基-4-甲基戊酸。采用HMRS結(jié)合NMR技術(shù)首次從白酒中鑒定出具有苦味特征的化合物9,10,13-三羥基-11(E)-十八烯酸和9,12,13-三羥基-10(E)-十八烯酸，并建立了其在白酒中的精確定量方法。文獻報道三羥基十八烯酸是亞油酸的氧化產(chǎn)物，而亞油酸是釀酒原料高粱中最主要的不飽和脂肪酸，因此推測白酒中的三羥基十八烯酸可能源于高粱中亞油酸的氧化分解。此外，有關(guān)白酒中脂肪的代謝產(chǎn)物及其對風味的影響也值得關(guān)注和進一步研究。