固態酵素食品的研究進展

韓宗元，李曉靜，葉豐，姜琦，韓齊，胡巧巧，肖志剛

1(沈陽工學院 生命工程學院，遼寧 撫順，113122) 2(沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽，110866) 3(沈陽師范大學 糧食學院，遼寧 沈陽，110034)

酵素是生物體所產生的具有催化作用的生物大分子，是一類特殊的具有催化功能的復雜酶類，人體可以自身合成一小部分，大部分需要飲食補充，并可產生大量益生元[1]。液態酵素是采用乳酸菌、酵母菌等多種益生菌發酵植物、動物與菌類等原料，形成富含多種生物活性的酶類(如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶等)、維生素、礦物質及代謝產物(乳酸、丙酸、丁酸和乙醇)的發酵食品[1]。

固態酵素是新興的酵素產品，從組織狀態及組成來看，它具有便于攜帶和運輸、易于保存、體積小、使用方便等特點，在品種、產量、功能性和保藏性等方面發展比較快，是功能性食品發展的重要方向[2]。固態酵素因為發酵菌種多、周期長、組織成分復雜、條件難控，且在干燥過程中活性成分易被破壞等問題，所以研究報道相對較少。本文介紹了酵素的發酵機理、功能性及固態酵素加工工藝的發展和應用現狀，提出現有固態酵素加工工藝存在的問題及可行的解決方法。

1 酵素發酵機理

酵素發酵是各種植物、動物與菌類等食品原料在微生物作用下發生的復雜過程，微生物在自身的新陳代謝和生長過程中，實現物質間的代謝轉化，使發酵原料在分子水平上發生分解和結構改變，產生具有多種生物活性的酶類和復雜代謝產物或中間代謝產物，同時酵素在發酵過程中會受到發酵的原料、菌種、溫度、時間等影響。酵素按其生產方式可分為自然發酵和人工接種發酵酵素。自然發酵是一種傳統的發酵方式，常用的微生物主要有酵母菌、米曲霉及乳酸菌；人工接種發酵主要是應用已知微生物菌種來進行酵素的發酵，可分為單一菌種發酵和多菌混合發酵[3]，常用的發酵菌種有酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等，多菌共同發酵作用可以形成獨特的風味，在共同發酵過程中菌種之間會相互作用，形成互利共生關系，有利于酵素的發酵過程。

在蘋果酵素自然發酵過程中，酵母菌等優勢菌種會優先利用蘋果酵素中的果糖、葡萄糖代謝成乙醇，蘋果酸會被體系中少量的乳酸菌通過蘋果酸發酵途徑代謝生成乳酸，并且影響總酚含量的變化，這些不僅與發酵原料以及發酵條件有關，也與微生物的相互作用有關，因此發酵過程中葡萄糖與果糖先升高后下降，乙醇在發酵14～21 d后產生，總酚含量與DPPH自由基清除率呈先升后降趨勢，均在21 d達到最大值[4]。對酵素發酵機理進一步研究，微生物對樹莓酵素液中的酚類物質進行代謝，總酚含量隨著發酵時間的延長而不斷地增加，可能是由于微生物把復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質[5]。

以米曲霉、酵母菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌等混合菌種人工接種發酵蘋果酵素，酵母菌和醋酸菌之間存在互利共生關系，酵母菌通過發酵把蔗糖轉化為葡萄糖和果糖，然后再利用果糖發酵產生乙醇，醋酸菌把葡萄糖轉化為葡萄糖酸，將乙醇轉化為醋酸；酵母菌也能促進乳酸菌的活性，產生CO2降低pH值，抑制雜菌繁殖，增加香氣物質，如：有機酸和萜類物質對酵素風味和感官評價起到較好的作用，研究證明酵母菌和乳酸菌在葛根發酵液中存在互利共生作用，酵素中的氧氣含量降低，酵母厭氧發酵開始，乙醇的濃度開始增加，但隨著發酵的進行，還原糖被不斷的消耗殆盡，代謝積累的乙醇抑制了酵母厭氧發酵，造成酵母轉化乙醇的速率降低，乙醇濃度下降[6]。嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌之間也存在共生關系，保加利亞乳桿菌分解酪蛋白，形成新的氨基酸和多肽能夠促進嗜熱鏈球菌更好的生長；而嗜熱鏈球菌在整個發酵過程中產生大量CO2和甲酸促進保加利亞乳桿菌的生長和代謝[7]。

采用DNA 芯片技術、DNA指紋圖譜、熒光定量PCR和Western blot等進一步在分子水平上研究酵素的發酵機理。研究發現乳酸菌與酵母菌共生作用受到信號分子AI-2 的變化規律影響，并深入探討LuxS/AI-2介導的群體感應系統的影響力，酵母菌促進或抑制乳酸菌產生信號分子AI-2 的時間點以及產生量的不同，可能與乳酸菌感應生理環境變化并作出相應的自我調節應激反應速度有關，也可能與LuxS基因的表達量有關[8]。乳酸菌與酵母菌之所以能夠在一個體系中共存，是因為酵母菌在發酵過程中為乳酸菌提供了許多營養因子，例如氨基酸、維生素和丙酮酸鹽等，在分子水平上酵母菌代謝產生的乙醇，乳酸菌產生的2-(5H)-呋喃酮以及2種菌種共同產生的異戊酸都是信號分子，有助于解釋共生機制；在基因水平上，DNA 芯片技術可以推斷混合培養過程中酵母菌產生的乙醇導致carB、pydB、pyrE和pyrR基因表達水平降低，這是因為乙醇的積累導致乳酸菌mRNA水平上負責各種新陳代謝途徑(像糖代謝、氨基酸合成等) 的功能基因發生變化[9]，這也解釋說明酵母菌和乳酸菌的互利共生作用。對嗜熱鏈球菌的細胞外蛋白酶(prtS)關鍵代謝基因研究發現prtS 能分解乳蛋白，提供肽類和氨基酸，使嗜熱鏈球菌在乳中快速生長，使酸奶快速酸化，并且一些具有高轉錄水平的dtpT，amiF，ilvC，ilvB，bcaT，livJ，ackA，codY基因也對酸奶快速酸化有相應調控作用，酸奶風味物質乙醛的含量與關鍵功能基因pdc(丙酮酸脫羧酶)、ald(乙醛乙醇脫氫酶)、lld(L-乳酸脫氫酶)表達呈顯著正相關，說明功能基因可調控發酵過程中代謝產物或代謝中間產物的生成[10]。并且通過PCR-DGGE技術分析酵素的微生物群落結構，確定優勢細菌菌群分布，DNA指紋圖譜反映了酵素中微生物的相對組成情況和優勢菌種[11]。

2 酵素功能性

酵素發酵過程中會產生多種具有生物活性的營養物質和酶類。不同的發酵原料所產生的主要營養物質和生物活性不同，營養物質主要包括多酚類、有機酸、氨基酸、維生素、礦物質和多糖等功能性成分，有機酸主要為草酸、蘋果酸、乳酸、綠原酸、咖啡酸和乙酸等[3]，氨基酸主要為天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸等，酶類主要包括超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶等。綜合酵素中含有的各項功能活性成分，諸多研究發現酵素具有多項有益功能，包括抗氧化功能[12-14]，免疫功能[15-16]，減肥[17-18]，護肝[19-20]，調節腸道菌群[21-22]，通便[23-24]，促進消化[25]等功能。

植物酵素中含有黃酮、多酚類抗氧化物質較多，核桃青皮果蔬酵素抗氧化物含量排序：抗壞血酸>總花青素>總黃酮>總多酚，且超氧化物歧化酶活性高達1 980.25 U/mL[26]；植物酵素中還含有多種氨基酸，對柘樹植物酵素中氨基酸進行分析，主要的氨基酸為天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸[27]。植物酵素發酵過程能提高DPPH自由基清除能力，并且多酚類物質和抗氧化能力成正相關[28]，這是由于乳酸菌可以促進植物在發酵過程中產生有益于人體健康的功能性物質，尤其是酚類物質可以通過乳酸菌轉化為生物活性代謝產物[29]，乳酸菌在發酵過程中可以增加植物類食品的總酚含量，因而發酵食品的抗氧化能力增強[30]。當植物細胞壁瓦解，抗氧化活性物質釋放出來，他們作為自由基清除劑和供氫體阻斷自由基鏈反應，反應原理為：F—OH+R· →F—O·+RH[31]。

植物酵素不僅具有抗氧化功能，還具有免疫功能和減肥功能，研究表明采用蘋果、香蕉、胡蘿卜等60余種新鮮的水果、蔬菜、菇類等原料發酵制得酵素中含有功能性低聚糖、氨基酸、有機酸等功能性成分，有機酸分別為咖啡酸、綠原酸、綠原酸甲酯等，酵素能有效提高小鼠體液免疫功能，且具有減肥功能[32]。進一步研究植物酵素可以起到解酒、護肝作用，葛根酵素通過減緩胃腸吸收乙醇速度并加速乙醇降解代謝來降低機體乙醇濃度，從而達到解酒的功效[6]；水果酵素可預防和修復酒精對小鼠肝臟的損傷，具有一定保護肝臟的效果[33]。

3 固態酵素食品的生產工藝

固態酵素食品工藝是在一定濕度的固體基質上無水發酵，一定濕度確保菌種的生長和代謝，真菌、酵母菌和細菌都能在固態發酵基質(水果皮、果蔬渣、谷物、甘蔗渣、大豆等物料)上進行固態發酵產生生物活性物質(酶、有機酸、抗生素、風味和香氣成分)，這些農產品殘渣既可以作為發酵基質促進營養吸收和活菌生長，也可以作為碳源和氮源有利于固態發酵。

在工業生產中固態發酵反應器主要分為靜態和攪拌型生物反應器，靜態反應器包括固定床反應器和多孔托盤式反應器見圖1，攪拌型反應器包括水平轉桶和攪拌轉桶見圖2。

A-固定床反應器：(1)氣泵；(2)空氣分布系統；(3)加濕器；(4)自動控溫反應裝置；(5)過濾器；(6)流量傳感器；(7)數顯控制裝置；(8)電腦終端；(9)圓柱形傳感器；B-多孔托盤式反應器圖1 固定床反應器和多孔托盤式反應器Fig.1 Lab-scale fixed bed bioreactors and perforated traysbioreactor apparatus for solid state fermentation

A-水平轉桶：(1)壓縮機；(2)空氣過濾器；(3)加濕器；(4)水平轉桶；(5)攪拌器；(6)電機；(7)速度控制器；(8)排氣裝置；(9)硅膠柱；(10)成分標識；(11)氣相色譜；(12)電腦B-攪拌轉桶：(1)進氣口；(2)旋轉接頭；(3)耦合器；(4)噴嘴；(5)空氣管路；(6)滾筒；(7)轉桶；(8)固體培養基；(9)線圈圖2 水平轉桶和攪拌轉桶反應器Fig.2 Schema horizontal drum and rotating drum bioreactor

圖1-A固定床反應器連接水浴循環裝置、氣泵和流量計，通過循環流體調節溫度，并可以自動清除代謝產生的CO2。圖1-B多孔托盤式反應器，發酵基質放在多孔的托盤上有助于空氣對流，托盤深度為5～15 cm，放置托盤的空間可以調節溫度和濕度。圖2-A為水平轉桶反應器，在1930年用于工業化固態發酵，內部有攪拌器和擋板，在攪拌過程中對菌絲的結構有破壞。圖2-B為攪拌轉桶反應器，在水平轉桶內可以使培養基進行翻騰運動，使混合較均一[34]。

固態發酵工藝主要用于納豆、豆豉、豆瓣醬、豆腐乳、白酒、醋、醬油等傳統食品的發酵。由于固態發酵存在無法攪拌或者混合不充分，發酵過程中發酵速率和溫度較難均一控制等問題[35]。田智斌等[36]通過固態發酵生產納豆激酶，工藝參數為接種量4%，初始含水量55%，大豆裝量90 g/250 mL，發酵溫度36.09 ℃，蔗糖添加量1.5%，MgSO4·7H2O 添加量0.21%，CaCl2添加量0.27%，發酵時間24 h。程友飛等[37]研究固態發酵豆粕得到最佳工藝參數：含水量 60%，發酵溫度 30 ℃，接種量 12%，枯草芽孢桿菌：干酪乳桿菌：酵母菌接種比例為 2∶1∶1，接種順序為先接種枯草芽孢桿菌24 h后，再接種干酪乳桿菌和酵母菌，發酵時間72 h。王艷平等[38]利用納豆芽孢桿菌發酵花生粕制備納豆激酶的最佳工藝條件：37 ℃下發酵 24 h，接種量10%，料水比1∶0.4，并且得到最佳真空冷凍干燥保護劑配比條件：β-環糊精5%、麥芽糊精10%、辛烯基琥珀酸淀粉鈉2%，此時納豆激酶活力保存率為74.2%。

現階段，谷物(米糠、糙米、大米)、水果(葡萄、藍莓、梨)、蔬菜(秋葵、桑葉)、菇類(香菇、金針菇、木耳)、藥食同源(葛根、人參)等原料主要采用酵母菌、乳酸菌和米曲霉等菌種進行液態發酵也稱作深層發酵，達到改善發酵基質原有的不良風味，并產生新的功能成分，增加酵素的功能性[39]。因為這些原料含有大量自由水，現階段，在酵素發酵工藝上不適合于固態發酵，固態發酵酵素工藝還需進一步完善。

而液態發酵受到環境中微生物、發酵體系和季節等條件影響大，容易受到雜菌的污染，很難控制產品的質量，以至于影響酵素產品的開發和利用，同時液態酵素作為食品添加劑用于面包、酸奶等發酵食品中不容易控制活菌(乳酸菌、酵母菌)數量。因此，新型固態酵素可以在液態酵素基礎上采用一定干燥技術，把大部分水從物料中去除得到具有生物活性的固態食品，可以達到脫水和濃縮的效果，同時減少液態酵素加工儲存過程中由于酵母菌未滅活，繼續產氣出現炸瓶等不良現象，且固態酵素體積小，便于運輸，攜帶方便。

但是液態酵素中含有多種活性物質，大多數都是熱敏性物質，存在玻璃態轉化溫度的問題，因此需要采用助干劑提高玻璃態轉化溫度來保護活性物質，常用助干劑為β-環糊精、大豆分離蛋白、可溶性淀粉、麥芽糊精和脫脂奶粉，所以助干劑可以改善干燥過程中出現黏結、焦糊、吸潮、板結、產率低等不良現象，并保護酵素的生物活性[40]。目前，常用去除食品中水分的方法：真空低溫噴霧干燥[41]、熱風干燥[42-43]、真空冷凍干燥[44-45]、真空低溫油炸[46]、噴霧干燥等[47-48]。研究證明黃酮、多酚等活性物質在噴霧干燥過程中，由于保護劑作用沒有破壞其結構，避免抗氧化能力降低，并延長儲藏時間和穩定性[48]，所以噴霧干燥等干燥方法在食品和藥品領域廣泛應用。

進一步比較熱風干燥與真空冷凍干燥的效果，熱風干燥效率、得率較高，但產品中營養物質的結構受到嚴重破壞，功能性降低；真空冷凍干燥的時間較長，但產品中功能性成分影響較小。研究證明真空冷凍干燥制得的桑葚果粉溶解性優于熱風干燥，得率和含水率低于熱風干燥，但熱風干燥對桑葚營養物質損失比較嚴重，真空冷凍干燥對桑葚的營養物質保持較好[49]；同時真空冷凍干燥使秋葵超微粉在物理特性、營養物質及生物活性方面優于熱風干燥[50]；進而對真空低溫油炸和真空冷凍干燥加工香菇脆片進行了比較研究，結果表明：真空冷凍干燥香菇脆片的硬度、脆度較大，感官品質較好，營養成分保留較好[51]，這說明真空冷凍干燥可用于富含活性營養成分的食品，尤其是液態食品，但干燥時間較長。為了縮短干燥時間，研究噴霧干燥對活性營養物質的影響，結果表明：噴霧干燥會改變蓮子蛋白的結構特性，并進一步影響其功能特性[52]。因此采用真空低溫噴霧干燥法進行干燥，既可以提高效率，并且能夠保護活性物質，研究表明真空低溫噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊，在真空度-0.05～-0.06 MPa，進風溫度79.07 ℃，進料速度727.54 mL/h，菌壁比1∶4.55，保護載體量(脫脂奶粉)9.80%，此條件下的活菌數為2.81×108CFU/g[41]。本團隊正在研究真空低溫噴霧干燥和真空冷凍干燥對新型固態酵素中總酚、花色苷、原花青素、總黃酮、類黃酮等含量和清除自由基能力的影響，最大限度保留酵素的營養成分，并改善固態酵素的風味和色澤，提高貯藏性和速溶性。

4 新型固態酵素存在的問題

新型固態酵素營養價值高、但易發生結塊和褐變、溶解性低等問題，新型固態酵素在速溶性和保藏性方面都與水分活度有密切的關系，水分對無定形粉體的玻璃化轉變溫度(Tg)和結晶起重要作用，影響其流動性、粘性和貯藏穩定性，進而影響食品的品質。在食品體系中，褐變最容易發生在Brunauer-Emmett-Teller(BET)單分子層，即水分活度在0.2～0.4范圍內，水分活度超過這個范圍，每增加0.1個水分活度單位，反應速率增加50%～100%，因此可以通過不同溫度下等溫吸濕曲線變化規律來預測食品的水分活度，進而控制食品的水分活度和品質[53]。新型固態酵素色澤鮮艷，營養豐富，在貯藏過程中Tg對產品的營養物質降解和損失有顯著的作用，控制Tg對其安全保藏具有重要意義，避免發生產品的粘結，色澤的降解、褐變。因此有必要研究新型固態酵素粉的Tg特性，為其加工和保藏奠定理論基礎。

5 結論與展望

酵素的發酵過程是植物、動物與菌類等原料自身營養物質在分子水平上的分解以及結構改變，并且微生物進行代謝產生中間產物和終產物的過程，同時采用混合多菌種發酵酵素對其感官評價與活性成分能起到重要的作用。隨著我國酵素技術的發展，將會分離出更多的益生菌推廣到酵素的加工過程中，豐富酵素的生物活性成分與功能。現階段研究酵素的主要的生物活性成分包括多酚類、有機酸、氨基酸、維生素、礦物質、多糖和功能性酶類等，這些物質在體內起到提高機體免疫力、抗氧化、潤腸通便等功能。

新型固態酵素能夠補充多種維生素、礦物質和膳食纖維，并且具有體積小、攜帶方便等優勢，成為功能性酵素發展的重要方向，通過真空冷凍干燥技術能更好地保持營養物質的生物活性。目前我國研究固態酵素技術還有待于發展，亟待解決固態發酵存在的混合不充分或發酵過程中發酵速率和溫度較難均一控制等問題，以及將發酵技術與干燥技術結合應用在酵素生產過程中，獲得功能性顯著的固態酵素，同時解決固態酵素易發生結塊、褐變和溶解性低等問題，最終為實現工業化奠定基礎。