通過AOM及AOM聯合DSS建立C57BL/6J小鼠結腸癌誘導模型的對比研究

曾一文 黎潔瑤 田曠怡 于濤 許稷豪 陳其奎

目前，結腸癌已成為世界第三高發腫瘤，在中國其致死率已達到第4位[1-2]。結腸癌的主要病理類型為結腸腺癌，人類大部分結腸腺癌呈現“早期癌前病變的異常隱窩灶(ACF)-腺瘤-腺癌”的發展規律[3]。在結腸癌研究中，使用氧化偶氮甲烷(AOM)這一致癌劑已成為嚙齒類動物結腸癌化學誘導建模的主要方法之一[4-5]。但不同研究使用AOM的藥物濃度及藥物暴露時間不一，AOM對小鼠結腸腫瘤的誘導效果結論不一[6-7]。而在AOM基礎上聯合使用葡聚糖硫酸鈉(DSS)這一促炎劑，在減少建模時間的同時可提高成瘤數量及體積。然而，不同的研究采用不同的DSS給藥循環方案，報道的結腸癌成模效果/效率不一，尚未有研究比較DSS不同循環方案小鼠的成模效果/效率，以便研究者根據自己的研究需要選擇合適的誘導方案并加以優化[8-9]。本實驗擬研究C57BL/6J小鼠在單獨給予不同劑量AOM或AOM聯合不同循環方案的2%DSS在不同暴露時間下結腸癌的誘導效率，探尋較為合理的AOM及AOM/DSS給藥的誘導方案，為研究結腸癌發生發展的化學誘導模型建立提供動物實驗的比較數據，使研究者在根據自己的研究需要選擇結腸癌化學誘導方案時有可循的科學研究基礎，推動結腸癌發生發展相關的科學研究進展[9-10]。

材料與方法

一、主要試劑和動物

AOM(Sigma公司，美國)，DSS(分子量36000 -50000，MP Biomedicals公司，美國)。SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，4周齡，256只。小鼠均由中山大學實驗動物中心提供，飼養于中山大學實驗動物中心，實驗室環境溫度為(23±3)℃，相對濕度為(55±15)%，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。小鼠進行普通飲食，每3 d更換墊料，水和食物隨時供應，飼料與墊料均由中山大學實驗動物中心提供。所有有關動物的實驗過程均在中山大學實驗動物倫理委員會的監督指導下完成，符合實驗動物倫理學要求。

二、主要方法

1.造模及分組

小鼠經適應性飼養1周(W)后，隨機分別單獨給予AOM或予AOM聯合DSS誘導結腸癌。

對于單獨給予AOM處理的小鼠，隨機分成4組(低AOM、中AOM、高AOM及AOM對照組)，每組24只，于W1、W2、W3、W4分別給予低、中、高濃度AOM(10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg)皮下注射，同期小鼠皮下注射0.1 ml/10 g生理鹽水作為對照。每組分別于W5、W8、W11、W14隨機各處死6只小鼠。

對于AOM聯合DSS處理的小鼠，隨機分為4組(DSS1、DSS2、DSS3及DSS對照組)，小鼠于W1皮下注射10 mg/kg的AOM，1周后予2% DSS溶液自由飲用7 d，隨后予正常飲用水2周。每1周DSS與2周正常飲用水為1個循環周期，DSS1、2、3組小鼠分別予以循環1次、2次、3次，小鼠數量分別為50只、41只、29只。DSS對照組有40只小鼠，于W1皮下注射0.1 ml/10 g生理鹽水。DSS1組和DSS對照組分別于W5、W8、W11、W14隨機各處死10只小鼠；DSS2組分別于W8、W11、W14隨機各處死10只小鼠；DSS3組分別于W11、W14隨機各處死10只小鼠。

2.標本采集

小鼠經頸椎脫臼法處死，沿腹中線打開腹腔，剪取自回盲部至直腸的腸段，使用預冷的PBS清洗腸道，沿長軸打開腸腔，仔細觀察并觸摸腸腔表面有無腫瘤形成。若結直腸未見腫瘤形成，則進行ACF的計數；若發現腫瘤形成，則進行腫瘤的計數觀察。

3.ACF計數

將腸道攤平并夾在兩張濾紙之間，用2 g/L亞甲藍染色20 min。腸道黏膜面向上，用光學顯微鏡在40×或100×觀察條件下，計數每個完整結腸中ACF的數量。正常隱窩鏡下呈類圓形，大小均勻，分布規則。ACF鏡下可見多個隱窩的融合，較正常隱窩深染[5]。

4.腫瘤計數和病理觀察

觀察并記錄其腫瘤的數量、大小、位置，測量并記錄每個腫瘤的最長徑和垂直短徑。分別切取每個腫瘤及其癌旁組織和正常組織，4%多聚甲醛固定，進行石蠟包埋，制備組織切片，蘇木素-伊紅染色后，于光學顯微鏡下觀察。按下述公式計算腫瘤體積、腫瘤發生率、平均成瘤數量和荷瘤小鼠平均成瘤數量：腫瘤體積=(最長徑×垂直短徑2)/2；腫瘤發生率(%)=荷瘤小鼠數量/實驗小鼠數量×100%；平均成瘤數量=腫瘤數量/實驗小鼠數量；荷瘤小鼠平均成瘤數量=腫瘤數量/荷瘤小鼠數量。

三、統計學處理

結 果

一、不同AOM濃度和不同DSS循環周期對小鼠死亡率的影響

低AOM組、中AOM組、高AOM組及AOM對照組均無小鼠死亡。DSS1組共有10只小鼠死亡，死亡率為20.00%；DSS2組共有11只小鼠死亡，死亡率為26.83%；DSS3組共有9只小鼠死亡，死亡率為31.03%；DSS對照組未見小鼠死亡。然而，AOM暴露濃度的增高和DSS循環周期的增加對小鼠的死亡率增長的影響并無統計學意義(P>均0.05)。

二、不同AOM濃度和暴露時間對小鼠ACF形成的影響

同一暴露時間下，隨著AOM濃度的增加，小鼠結腸ACF的平均數量增加(P均<0.05，表1)；同一暴露濃度下，隨著AOM暴露時間的增加，小鼠結腸ACF的平均數量也可見增加(P均<0.001，表1)。在開始AOM暴露的4周時，異常隱窩在鏡下主要表現為單個隱窩的變化，可見隱窩體積增大，腺細胞膜增厚、染色加深(圖1A)；隨著暴露時間的增加，ACF的隱窩數量和體積均有所增加增大(圖1B)。

表1 不同濃度AOM處理組小鼠結腸ACF的數量 個

圖1 小鼠結腸ACF的亞甲基藍染色

A：箭頭所示為中AOM組(15 mg/kg)W5時小鼠結腸形成的一個ACF，由單個隱窩構成，體積較正常隱窩增大，染色加深(×100)；B：箭頭所示為中AOM組(15 mg/kg)W14時小鼠結腸形成的一個ACF，由多個隱窩融合構成，染色加深，體積明顯增大(×40)

三、不同DSS循環周期對小鼠結腸腫瘤形成的影響

顯微鏡下觀察，腫瘤為腺瘤伴高級別上皮內瘤變。與正常對照組相比，可見腺體排列紊亂、腺細胞大小不一、核大深染、核型不規則、病理性核分裂像等(圖2)。

圖2 AOM/DSS處理組中正常結腸組織和腫瘤組織的蘇木素-伊紅染色

A：正常小鼠結腸由黏膜層、黏膜下層、固有肌層和漿膜層構成。腸腺呈長管狀，可見大量空泡狀的杯狀細胞(×40)；B：腺瘤伴高級別上皮內瘤變。腫瘤呈外生性生長，腺體擁擠、排列紊亂，杯狀細胞比例較正常減少。腫瘤腔面呈高級別上皮內瘤變改變，腺體更為擁擠紊亂，部分腺體喪失圓管狀排列，呈不規則型。腫瘤邊界清楚，未侵及黏膜肌層(×40)；C：腺體排列紊亂，細胞異型伴核深染(×100)；D：左側腺體仍保持管狀形態，由單層細胞構成，杯狀細胞比例較正常腺體減低，細胞核大小較均一，未見病理性核分裂；右側腺體喪失管狀形態，腺體部分區域由多層細胞構成，未見正常的杯狀細胞，細胞核較左側腺體染色更深，細胞核大小不均，可見病理性核分裂現象(×400)

AOM聯合DSS可使小鼠結腸形成腺瘤伴高級別上皮內瘤變，相比DSS一循環，DSS二、三循環可顯著增加腫瘤發生率、平均成瘤數量、荷瘤小鼠平均成瘤數量及腫瘤體積(P<0.05或0.008)，見表2。

表2 不同DSS循環周期對小鼠腫瘤形成的影響

續表

組 別處理周數n帶瘤鼠數腫瘤發生率(%)腫瘤個數平均成瘤數量(個/只)荷瘤小鼠平均成瘤數量(個/只)腫瘤體積(mm3)W81000.000000W111000.00eg00eg0df0W141000.00eg00eg0df0

注：與本組W8比較，aP<0.017；與DSS1組比較，bP<0.05,cP<0.008；與DSS2組比較，dP<0.05,eP<0.008；與DSS3組比較，fP<0.05,gP<0.008

討 論

AOM作為一種常用的結腸癌建模藥物，可通過引起鳥嘌呤甲基化誘導突變損傷，促進嚙齒類動物結腸癌模型的形成，其成癌過程也符合人類結腸癌80%發病的機制，即“正常腸黏膜-ACF-腺瘤-腺癌”的動態變化過程[1，10-13]。在使用AOM的基礎上加用DSS，可在化學藥物致癌的基礎上，重復誘導腸道上皮損傷與修復的慢性炎癥狀態，形成炎癥相關性結腸癌模型，更可增加小鼠模型的成瘤效率，減少腫瘤形成時間[1,10,14-15]。由于目前文獻報道的AOM及AOM/DSS相關動物實驗采用不同的給藥濃度及實驗周期，對其實驗結果進行評價分析則相對困難，本實驗通過研究不同藥物濃度、給藥周期及暴露時間下，AOM和AOM聯合DSS對C57BL/6J小鼠腸癌成模效果/效率的影響，探尋較為合理的誘導方案，提供結腸癌化學誘導模型動物實驗的比較數據，在一定程度上為早期干預治療腸癌的研究提供了新的思路和標準，具有較大的實驗意義和價值[4,6-9]。

ACF目前被認為是結直腸癌成癌過程中可在光鏡下觀察到的最小、最早期的結腸黏膜上皮的癌前病變，其發生被認為和最終的結腸腫瘤發生有著密切的關系[16]。在亞甲藍染色的光鏡觀察下，ACF表現為腺管染色加深、面積增大；腺細胞上皮層增厚，細胞核的不典型增生現象[17]。AOM可通過誘導K-Ras、β-catenin等基因的突變誘發ACF形成，進而促進結腸癌的發生發展。本研究顯示，小鼠腸道ACF的形成與注射的AOM劑量和總實驗時間密切相關。隨著AOM藥物濃度的增加，小鼠結腸ACF的平均數量明顯增加，提示在小鼠腸癌模型中，AOM既是腫瘤誘發劑，又起著腫瘤生長促進劑的作用。隨著實驗時間的增加，小鼠結腸ACF的平均數量顯著增加，光鏡下觀察到的ACF也由單個隱窩細胞的深染、上皮層增厚，變為多個異常隱窩融合形成的增生灶，揭示了腸道癌前病變隨著時間進展的發生發展情況。

DSS作為促炎劑，可抑制腸上皮細胞增生，影響細胞DNA合成，破壞腸黏膜屏障，導致巨噬細胞功能障礙及腸道菌群失調，反復誘導小鼠腸黏膜炎癥形成[15]。在AOM的基礎上聯合DSS建模，可影響APC、β-catenin、K-Ras、COX-2、iNOS等基因，促進隱窩細胞增生，改變隱窩細胞正常代謝和膽汁酸腸肝循環，破壞腸道菌群生長平衡，最終誘發腫瘤形成[9]。本研究顯示，AOM聯合DSS建立的C57BL/6J小鼠模型中，其結腸腫瘤的病理類型為腺瘤伴高級別上皮內瘤變，病變尚未侵及黏膜下層，這或受實驗時間所限。在采用1次10 mg/kg的AOM皮下注射結合DSS2循環的實驗組中，W14的腫瘤發生率是W8的7倍；其平均成瘤數量是W8的14倍，平均成瘤數量的中位數也是W8的10倍，提示在該給藥方案下，增加實驗時間可有效增加成瘤效率。然而W11和W14的各項腫瘤評估指標未見統計學差異，這或提示在此方案下，小鼠腸癌模型存在誘導腫瘤生成的平臺狀態。

另外，在W11，DSS2或DSS3循環組較DSS1循環組的腫瘤發生率和荷瘤小鼠平均成瘤數量可見顯著增加，且DSS3循環組較DSS2循環組的腫瘤體積也有明顯增加，說明DSS循環周期的增加可顯著提高AOM聯合DSS方案的成瘤效果/效率。然而在W14，DSS3循環組較DSS2循環組未見上述指標的變化，這或提示與單獨使用AOM的方案相似，AOM/DSS方案也存在誘導腫瘤生成的平臺狀態，在該平臺狀態，腫瘤數量不再增加，而是表現為體積的增大。

在本次共計14周的實驗中，單獨使用AOM并未形成結腸腫瘤，相同時間下AOM聯合DSS則可誘發腫瘤生成，驗證了AOM/DSS方案可有效提高結腸癌動物模型的成瘤效能，結直腸癌的發生發展是多因素、多步驟長期共同作用的結果，結腸的炎癥損傷可明顯提高致癌劑的致癌效率。此外，AOM各實驗組未見小鼠死亡，提示小鼠對AOM的耐受性良好；DSS各實驗組均有小鼠死亡，并主要發生在DSS飲水的一周內，但死亡率并無統計學差異，這或受較小的樣本量所限。

綜上所述，我們探討了AOM或AOM聯合DSS不同藥物劑量、給藥周期及暴露時間對建立結腸癌誘導模型效果的差異。我們認為，以ACF為目的和判斷標準的AOM建模方案中，20 mg/kg AOM皮下注射，每周1次，共4周，W14中止實驗為成本效益較佳的方案。以腫瘤形成及其數量體積為判斷標準的AOM/DSS建模方案中，于W1對小鼠皮下注射1次10 mg/kg AOM，再分別于W2和W5給予2次持續7 d的2%DSS替換正常飲水后，于W11進行腸道取材，為成本效益較佳的實驗方案。