藏藥五味甘露藥浴顆粒對(duì)AA模型大鼠的藥效作用研究

天虹*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)管理學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137；3.西藏藏醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩 850000

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)屬于藏醫(yī)“真布病”范疇，在藏區(qū)是一種常見疑難性疾病，其發(fā)病率高，致殘率高，并可累及多器官、多系統(tǒng)引起系統(tǒng)性疾病。藏藥浴療法是藏醫(yī)治療RA臨床效果確切的常用手段，其在治療風(fēng)濕病、類風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)病等方面療效顯著。藏藥浴最基本的經(jīng)典組方是記載于《四部醫(yī)典》的“五味甘露方”。臨床數(shù)據(jù)表明，藏藥浴療法可以提高RA患者的免疫功能，具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛效果[1-3]。但是五味甘露藥浴顆粒對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)藥效機(jī)制報(bào)道相對(duì)缺乏[4-5]，其對(duì)RA滑膜細(xì)胞以及關(guān)節(jié)功能和形態(tài)的干預(yù)作用的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)在藏醫(yī)學(xué)理論和臨床治療經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)下，建立佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant Arthritis，AA)大鼠模型，觀察五味甘露藥浴顆粒對(duì)致炎側(cè)足趾腫脹度、足踝關(guān)節(jié)滑膜病理改變等藥效作用。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD種大鼠(SPF級(jí))60只(購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司)，體重(200±20)g，日齡(40±5)d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-24。在成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周之后實(shí)驗(yàn)。

1.3 材料 弗氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant，規(guī)格：1 mg/mL，滅活結(jié)核桿菌，批號(hào)：#SLBF 9338V，Sigma公司)。卡介苗凍干粉(規(guī)格：60 mg/支，批號(hào)：201409，上海瑞楚生物科技有限公司)。1 mg·mL-1弗氏完全佐劑中加入一定劑量滅活的卡介菌，制備成10 mg/mL滅活結(jié)核桿菌的弗氏完全佐劑，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩４姿岬厝姿善?Dexamethasone Acetate Tablets，規(guī)格：0.75 mg/片，批號(hào)：130123，由浙江仙琚制藥股份有限公司)。

1.4 儀器 PV-200足趾容積測(cè)量?jī)x(成都泰盟科技有限公司)；徠卡-2016轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司)；BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀(美國(guó)Thermo公司)；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)。

2 方法

2.1 AA模型大鼠的建立及給藥方案 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為6組，每組10只：①正常對(duì)照組(C)；②AA模型對(duì)照組(AA)；③地塞米松組(D)；④五味甘露藥浴高劑量組(H)；⑤五味甘露藥浴中劑量組(M)；⑥五味甘露藥浴低劑量組(L)。參照文獻(xiàn)[6-7]，于正常對(duì)照組(C)大鼠右后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL生理鹽水，其它五組(AA組、D組、H組、M組、L組)每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL弗氏完全佐劑，建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。在致炎兩周后，對(duì)H組、M組和L組大鼠進(jìn)行五味甘露藥浴療法。將這三組大鼠固定于底部直徑約30 cm，高約20 cm的圓柱形木桶內(nèi)，使大鼠雙側(cè)下肢浸泡在2 L的藥液中，藥液的濃度分別為：H組11.80 g/L、M組5.90 g/L、L組2.95 g/L，水溫控制在38～42 ℃，每天1次，每次30 min。藥浴7 d為1個(gè)療程，連續(xù)治療4個(gè)療程，每個(gè)療程結(jié)束休息2d。C組和AA組每天同體積淡水溫水浴，給藥條件同五味甘露藥浴組。D組每天醋酸地塞米松0.15 mg/kg灌胃1次，給藥療程參照五味甘露藥浴組。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 足容積測(cè)量 造模前用足容積測(cè)量?jī)x對(duì)每只大鼠右后足足容積測(cè)量2次，取兩次測(cè)量值的平均數(shù)作為基礎(chǔ)值。大鼠造模兩周后開始給藥，分別于給藥第1周、第2周、第3周、第4周測(cè)定致炎側(cè)(右后足)足容積，計(jì)算出原發(fā)性足腫脹度(△mL=致炎后足容積平均值-致炎前足容積的平均值)[8]。

2.2.2 免疫器官臟器系數(shù) 大鼠造模成功，并連續(xù)用藥四周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，先對(duì)各組大鼠稱體重、記錄。采用麻醉方法處死大鼠，摘取胸腺、脾臟分別在電子天平上精密稱重、記錄。用公式：臟器系數(shù)=臟器濕重(mg)/動(dòng)物體重(g)×100%，計(jì)算臟器系數(shù)。

2.2.3 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理學(xué)觀察 麻醉取血處死大鼠，取右側(cè)后足(致炎側(cè))踝關(guān)節(jié)，沿關(guān)節(jié)正中切開皮膚，暴露出以踝關(guān)節(jié)為中心的約3 cm×3 cm區(qū)域，有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，剝離部分組織，制備石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟后放染色架上，放入蘇木精染液缸染色10～20 min，水洗后入1 %的鹽酸內(nèi)分色30 s。水洗后取出放50 ℃的溫水中或弱堿性水溶液反藍(lán)，出現(xiàn)藍(lán)色后水洗，鏡檢染色效果，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿不著色。放伊紅染液缸內(nèi)染色，用75 %～95 %濃度梯度乙醇逐級(jí)脫水，然后透明、封片。以常規(guī)光學(xué)顯微鏡觀察，并以圖像分析系統(tǒng)測(cè)定積分光密度，觀察滑膜組織的病理變化。

3 結(jié)果

3.1 足容積測(cè)量結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，AA模型對(duì)照組大鼠右后足于注射弗氏完全佐劑后產(chǎn)生明顯腫脹(P<0.01)，右后足足腫脹在致炎兩周左右達(dá)到峰值。與AA模型對(duì)照組比較，地塞米松組與五味甘露藥浴顆粒低劑量組在給藥1至4周原發(fā)性足跖腫脹度均有顯著的減小(P<0.01)；五味甘露藥浴顆粒中劑量組、五味甘露藥浴高劑量組也能明顯的抑制大鼠的原發(fā)性足腫脹(P<0.05)。見表1、圖1。

組別劑量足腫脹度(△mL)給藥前給藥一周給藥二周給藥三周給藥四周正常對(duì)照-0.194±0.097??0.033±0.128??0.105±0.083??0.131±0.137??0.080±0.185??模型對(duì)照-1.714±0.3111.609±0.2591.556±0.3591.384±0.2791.267±0.362地塞米松0.15mg·kg-11.620±0.3150.589±0.318▲▲0.613±0.432▲▲0.416±0.244▲▲0.619±0.334▲▲五味甘露藥浴顆粒2.95g·L-11.429±0.368 1.082±0.316▲▲1.061±0.391▲▲0.860±0.440▲▲0.762±0.312▲▲5.90g·L-11.582±0.2921.341±0.288▲1.148±0.211▲▲1.041±0.260▲0.873±0.377▲11.80 g·L-11.792±0.4361.482±0.3601.266±0.197▲1.078±0.326▲0.927±0.324▲

注：正常組與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01；給藥組與模型組比較，▲P<0.05、▲▲P<0.01。

3.2 免疫器官臟器系數(shù) 與正常組對(duì)照組比較，AA模型對(duì)照組脾臟系數(shù)顯著增大(P<0.01)。與AA模型對(duì)照組相比，地塞米松組胸腺系數(shù)顯著減小(P<0.01)；五味甘露藥浴顆粒高、中、低劑量組大鼠免疫器官?zèng)]有明顯的變化(P>0.05)。見表2、圖2。

組別劑量胸腺系數(shù)脾臟系數(shù)正常對(duì)照-0.098±0.0250.201±0.026??模型對(duì)照-0.094±0.0200.238±0.026地塞米松0.15mg·kg-10.052±0.015▲▲0.237±0.062五味甘露藥浴顆粒2.95g·L-10.103±0.0230.269±0.0835.90g·L-10.100±0.0250.255±0.04611.80 g·L-10.116±0.0270.267±0.039

注：正常組與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01；給藥組與模型組比較，▲P<0.05、▲▲P<0.01。

3.3 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理學(xué)觀察 正常對(duì)照組(C)大鼠滑膜組織滑膜細(xì)胞單層，排列整齊，無(wú)血管增生，無(wú)纖維化，無(wú)乳頭狀增生；軟骨組織結(jié)構(gòu)層次清晰，骨小梁整齊、排列有序，無(wú)斷裂、扭曲，未見滑膜細(xì)胞增生增厚、巨噬細(xì)胞增生和間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)部分。AA模型對(duì)照組(AA)滑膜細(xì)胞多層，增生活躍，滑膜組織中纖維組織增生，毛細(xì)血管增多擴(kuò)張充血，可見大量炎細(xì)胞及纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨組織表面基本完整，局部細(xì)胞彌漫增生簇集。地塞米松組(D)滑膜細(xì)胞增生，細(xì)胞層數(shù)稍有增加，滑膜組織中纖維組織增生，毛細(xì)血管增多擴(kuò)張充血，可見炎細(xì)胞及纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)。

五味甘露藥浴顆粒高劑量組(H)滑膜細(xì)胞增生，細(xì)胞層數(shù)稍有增加，滑膜組織中纖維組織輕度增生，毛細(xì)血管增多擴(kuò)張充血，可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤(rùn), 軟骨組織表面基本完整，局部細(xì)胞彌漫增生簇集，潮線基本完整，未見有軟骨下血管入侵潮線。五味甘露藥浴顆粒低劑量組(L)滑膜細(xì)胞增生，細(xì)胞層數(shù)較高劑量組明顯增加，滑膜組織中纖維組織大量增生，毛細(xì)血管增多擴(kuò)張充血，可見淋巴、單核細(xì)胞及纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤(rùn), 軟骨組織表面基本完整，局部細(xì)胞彌漫增生簇集，潮線基本完整出現(xiàn)多重潮線，偶見有軟骨下血管入侵潮線。五味甘露藥浴顆粒中劑量組(M)滑膜細(xì)胞增生，細(xì)胞層數(shù)明顯增加，滑膜組織中纖維組織增生，毛細(xì)血管增多擴(kuò)張充血，可見淋巴、單核細(xì)胞及纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤(rùn), 軟骨組織表面基本完整，病變程度介于高劑量組及低劑量組之間，見圖3。

4 討論

RA是一種以慢性滑膜炎癥導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)損害為特征的疑難疾病，其發(fā)病率高，致殘率高，并可累及多器官、多系統(tǒng)引起系統(tǒng)性疾病[9]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)RA的治療目標(biāo)主要是讓患者盡早達(dá)到癥狀緩解狀態(tài)并長(zhǎng)期維持穩(wěn)定[10]。目前應(yīng)用于治療RA的常規(guī)藥物，如非甾類抗炎藥(NSAIDS)、慢作用抗風(fēng)濕藥、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素(GC)等[11-12]，主要側(cè)重于治療炎癥和關(guān)節(jié)軟組織腫脹，但不能有效地防止軟骨破壞，且有一定的毒副作用。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥主要累及身體各處關(guān)節(jié)，臨床體征一般表現(xiàn)為手、足、腕、踝等小關(guān)節(jié)和肘、肩、髖、膝等大關(guān)節(jié)的紅、腫、熱、痛的炎癥反應(yīng)，以及關(guān)節(jié)部位的畸形、類風(fēng)濕結(jié)節(jié)的出現(xiàn)和類風(fēng)濕血管炎的表現(xiàn)等。本實(shí)驗(yàn)中AA模型大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎在體征上表現(xiàn)為致炎側(cè)關(guān)節(jié)的原發(fā)性足腫脹，足趾端出現(xiàn)壞死、皮膚潰瘍，尾部有類風(fēng)濕結(jié)節(jié)的出現(xiàn)。經(jīng)五味甘露藥浴顆粒治療后，原發(fā)性足腫脹有明顯下降的趨勢(shì)，踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)有所改善，大鼠的胸腺、脾臟系數(shù)有升高的趨勢(shì)，提示該藥可以明顯減輕關(guān)節(jié)炎癥程度，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)具有抗炎消腫的治療作用。