雛鳳膏對乳腺上皮細胞MCF 10A增殖的影響及機制研究

浙江中醫藥大學藥學院藥理研究所，浙江 杭州 311402

乳頭皸裂(nipple trauma)作為哺乳期的常見病之一，在世界各地具有較高的發病率，處理不當時可以引起局部滲血、潰瘍甚至導致乳癰。研究顯示，由于乳頭皸裂所引起的疼痛和焦慮通常會導致產婦放棄母乳喂養和早期斷奶[1-2]。然而，母乳中包含大量對嬰兒有益的生物活性物質，具有營養、抗菌及免疫調節等多種功能，對母親而言可以幫助子宮收縮、減少乳腺癌和卵巢癌等的危險[3]。因此，乳頭皸裂的治療對推進母乳喂養顯得至關重要。

中醫驗方蛋黃油，古籍中稱為“雛鳳膏”，性平，味甘，具有解毒消腫，斂瘡生肌之效[4]。蛋黃油的臨床應用歷史悠久，始見于北周姚僧垣撰《集驗方·卷九》，云：“治湯火燒瘡方，熟雞子一十個，取黃，炒取油，入十文膩粉，攪勻，用雞翎掃瘡上，三、五日，永除瘢痕”[5]。此外在《本草綱目》等諸多書籍中均有記載[6]。研究表明，蛋黃油中含有脂肪類、蛋白質氨基酸類、維生素、礦物質四類成分，其中維生素A、維生素D和卵磷脂等物質對人體皮膚的再生和代謝有著重要作用[7]。此外，雛鳳膏中還添加有芝麻油和純天然羊毛脂。關于蛋黃油用于燙傷、乳頭皸裂等的研究[8-10]已有報道，但是雛鳳膏治療乳頭皸裂的具體機制研究還未見報道。研究針對雛鳳膏對乳腺上皮細胞MCF 10A細胞的增殖影響及機制展開深入的探究，希望為雛鳳膏應用于乳頭皸裂的治療提供理論依據，從而進一步推進母乳喂養。

1 材料

1.1 細胞 乳腺上皮細胞MCF 10A購買于中國科學院上海細胞庫

1.2 雛鳳膏的制備 蛋黃油提取物1份;芝麻油0.5～1.5份;純天然羊毛脂1.5～2.5份。其中，所述的蛋黃油提取物的制備方法如下：

將雞蛋煮熟，剝取蛋黃，壓碎，用食品級乙酸乙酯冷浸或超聲提取，得到的提取液減壓回收乙酸乙酯，得到所述的蛋黃油提取物。

取純羊毛脂4份，置于容器中，加熱至約45?C，將羊毛脂熔化，再加入2份蛋黃油中間體，1份芝麻油基質，熔合，不斷攪拌，冷卻至室溫，即得雛鳳膏。

1.3 試劑 MCF 10A專用培養基(Lonza公司批號cc-4136)；0.25% Trypsin-EDTA (GENVIEW 公司批號49120010100)；青霉素-鏈霉素(吉諾生物醫藥技術有限公司批號12123101)；RIPA裂解液(碧云天生物批號P0013C)；碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司批號P0011)；四甲基亞唑藍(MTT)(美國SIGMA公司批號M2128)；DMSO(美國SIGMA公司批號WXBB1799V)；細胞周期染色液(BD公司批號 5205995)；一抗cyclin E1、cdk2(戴格生物科技生物有限公司批號 db1668、db299、)、p21(abcam公司批號 18209)、β-Actin、β-Tubulin(CST公司批號 #4970、#2128)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(BIO-RAD公司批號350001312)；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗(BIO-RAD公司批號350003248)；ECL顯影液(BIO-RAD公司批號102030719)

1.4 儀器 3111型二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；ECLIPSE Ti型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；BSA124S-CW電子天平(北京賽多利斯電子有限公司)；L500型臺式離心機(湖南相儀實驗室儀器開發有限公司)；HHS-11-1型恒溫水浴箱(上海博迅醫療設備廠)；MDF-U3386S 型超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；轉移脫色搖床(姜堰市普康醫療機械廠)；電泳儀(美國BIO-RAD公司)；化學發光成像系統(中國CLinX公司)；guava流式細胞儀(美國Minipore公司)；移液槍(多規格)(德國Eppendorf公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 MCF 10A細胞株培養于MCF 10A專用培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每2天換液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，大豆胰蛋白酶抑制劑抑制消化，按1∶3傳代，置37 ℃、5% CO2培養箱內繼續培養用于后續實驗。

2.2 MTT法檢測細胞相對存活率 收集對數期細胞，調整細胞密度為2000個/孔，每孔100 μL加入到96孔板，置37 ℃含有5% CO2培養箱培養。待細胞貼壁后加入雛鳳膏，其藥液終濃度分別為0 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1,用藥組和對照組均設8個復孔繼續培養96 h，每孔加入20 μL濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，置于培養箱中繼續培養，4 h 后每孔加入 200 μL 三聯液使藍紫色結晶甲瓚溶解，18 h 后用酶標儀在 570 nm 處測定其 OD 值。重復實驗3次，以平均值統計結果，計算各濃度下細胞相對存活率。細胞活力(%)=(加藥組OD570-空白組OD570)/(對照組OD570-空白組OD570)×100%。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 實驗分組：對照組、60 μg·mL-1雛鳳膏組、120 μg·mL-1雛鳳膏組。將狀態良好的乳腺上皮細胞MCF 10A以3×105/孔傳代于6 cm皿中，等待細胞貼壁之后，按照分組的情況加入含有不同濃度的雛鳳膏的完全培養基，繼續培養96 h后用PBS洗2遍，用胰酶消化后，用PBS重懸細胞，洗滌離心后立即加入70%的冰乙醇，保存在4 ℃過夜，細胞固定好之后，將前一天的細胞懸液在離心機上離心，吸去用于固定的乙醇，再用冷的PBS洗滌細胞兩次，除去上清液，加入含有RNase的PI染液，避光室溫染色30 min，流式細胞儀檢測每組細胞中的熒光強度，獨立實驗重復3次。

2.4 Western Blot檢測細胞周期相關蛋白及與生長有關蛋白 實驗分組：對照組、60 μg·mL-1雛鳳膏組、120 μg·mL-1雛鳳膏組。將狀態良好的乳腺上皮細胞MCF 10A以3×105/孔傳代于6 cm培養皿中，等待細胞貼壁之后，按照分組的情況加入含有不同濃度的雛鳳膏的完全培養基，繼續培養96 h后，各組細胞加入裂解液，冰上裂解30 min后離心(12000 r·min-1)取上清，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，處理蛋白隨后上樣，用SDS-PAGE分離總蛋白，隨后用濕轉法轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Cyclin E1、Cdk2、p21、EGFR、p-EGFR、Erk、p-Erk、GAPDH抗體孵育過夜后，加入相對的二抗(1∶3000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL法顯影，化學發光后拍照。GAPDH用于蛋白的內參。

2.5 統計學處理 每組實驗重復3次，實驗結果用SPSS 22.0統計軟件進行分析，采用兩獨立樣本t檢驗統計學方法，當*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001時差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 雛鳳膏對MCF 10A細胞增殖活性的影響 用不同濃度的藥物雛鳳膏(0，5，10，20，40,80,160 μg·mL-1)處理MCF 10A細胞72 h后，采用MTT法檢測細胞增殖活力，并繪制量效曲線(表1、圖1)。通過MTT實驗發現雛鳳膏對乳腺上皮細胞MCF 10A具有明顯的增殖作用并具有劑量依賴性。

3.2 雛鳳膏對乳腺上皮細胞MCF 10A周期的影響

3.2.1 流式細胞儀檢測細胞周期實驗結果 本研究采用不同濃度的雛鳳膏對MCF 10A細胞處理72 h后用PI單染，流式細胞儀檢測細胞周期變化情況，結果顯示，雛鳳膏能加快MCF 10A的G1/S期轉換，增加其S期細胞數目，見表2、圖2。

表1 雛鳳膏對乳腺上皮細胞MCF 10A細胞活力的影響

表2 不同濃度的雛鳳膏 (0、60、120 μg·mL-1)處理72 h后，流式細胞儀檢測MCF 10A細胞周期變化

3.2.2 Western Blot檢測周期相關蛋白 Western Blot 結果顯示(表3、圖3)，用雛鳳膏處理72 h后的MCF 10A細胞G1/S期相關蛋白Cyclin E1，cdk2以及p21的表達發生了變化。Cyclin E1，cdk2 蛋白表達水平升高，p21蛋白表達水平降低，表明雛鳳膏促進乳腺上皮細胞MCF 10A增殖是通過加快細胞周期轉換實現的。

3.3 雛鳳膏對乳腺上皮細胞MCF 10A EGFR/Erk通路的影響

3.3.1 Western Blot檢測EGFR/Erk通路相關蛋白 Western Blot 結果顯示(表4、圖4)，用雛鳳膏處理72h后的MCF 10A細胞EGFR/Erk通路相關蛋白表達發生變化。即p-EGFR、p-Erk蛋白表達升高，表明雛鳳膏促進MCF 10A增殖可能與EGFR/Erk通路有關。

表3 不同濃度的雛鳳膏(0、60、120 μg·mL-1)作用于MCF 10A細胞72 h后，Image J 計算cyclin E1、cdk2、p21蛋白的總灰度值變化，β-tubulin 作為內參對照。

表4 不同濃度的雛鳳膏(0、60、120 μg·mL-1)作用于MCF 10A細胞72 h后，Image J 計算p-EGFR、EGFR、p-Erk、Erk蛋白的總灰度值變化，β-actin 作為內參對照。

4 討論

乳頭皸裂作為哺乳期的常見病之一，已經成為產婦放棄母乳喂養的主要原因之一，雖已有藥物治療乳頭皸裂，但考慮到里面的添加劑對嬰兒的危害，大多數產婦不愿使用，而雛鳳膏作為一種中醫驗方，來源純天然、沒有添加劑、無毒副作用，具有“生肌長肉”的功效。本實驗利用MTT實驗發現，雛鳳膏對于乳腺上皮細胞MCF 10A具有明顯的增殖作用，并且呈現劑量依賴性。隨后，對雛鳳膏促進乳腺上皮細胞的機制進行研究。而細胞生長、增殖的調控主要跟細胞周期和信號通路等有關。

細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，從而實現細胞的增殖，包括G1、S、G2、M四個階段。在G1/S與G2/M兩個過渡期各有一個檢查點，分別制止G1期受損DNA進入S期進行復制和G2期受損DNA進入M期進行有絲分裂，從而中止細胞周期[11]。流式細胞術結果顯示雛鳳膏能夠使MCF 10A細胞雛鳳膏能加快MCF 10A的G1/S期轉換，增加其S期細胞數目，達到促進增殖的作用。細胞周期受細胞精確、有序的調控，其中，細胞周期蛋白E( cyclin E)、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin- dependent kinase 2, cdk 2) 是細胞周期調控中的關鍵大分子之一，cyclin E與cdk2結合，成為細胞從G1進入S期的關鍵激酶復合物[12-14]P21蛋白能夠抑制各種Cyclin E-cdk 2復合物的活性，負性調節Cyclin E- cdk 2 功能。Western Blot結果顯示雛鳳膏能夠引起MCF 10A細胞G1/S期相關蛋白表達的變化，即上調cyclin E1、cdk 2的表達，下調p21的表達，表明雛鳳膏通過加快MCF 10A細胞G1/S期的轉換，加快細胞周期進程，達到促進增殖的目的。

表皮生長因子(EGFR)作為一種膜受體，二聚體化和磷酸化后，與其下游相應的信號轉導分子發生相互作用，并將其激活。這些信號通路包括MEK/ERK及PI3K/AKT 信號通路等[15-16]，通過這些信號通路將有絲分裂的信號從細胞外傳遞到細胞內，從而有效調節細胞增生、分化及生長等[17-18]。基于上述EGFR對細胞生長、增殖的調控作用，我們推測雛鳳膏的促進乳腺上皮細胞增殖可能與促進EGFR的活化有關。Western Blot結果顯示雛鳳膏能夠促進MCF 10A 的EGFR的磷酸化，并且還同時促進Erk的磷酸化，且呈現明顯的劑量依賴性。因此，推測雛鳳膏促進MCF 10A的增殖可能與激活EGFR/Erk通路有關。

雛鳳膏作為一種中醫驗方，純天然、無毒，營養豐富，本實驗發現雛鳳膏可以促進乳腺上皮細胞的增殖，其機制可能與縮短細胞周期、激活EGFR/Erk通路有關，希望為雛鳳膏臨床治療乳頭皸裂提供理論依據，從而推進母乳喂養。