甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB2對肝癌侵襲遷移的影響及其機(jī)制研究

賈龍梅，殷香寶，曾磊，陳新，饒燕飛

肝細(xì)胞肝癌（HCC）是最常見的肝臟原發(fā)性腫瘤［1］。由于臨床癥狀隱匿且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，大部分HCC患者被診斷時即已經(jīng)是腫瘤晚期，因而失去了手術(shù)或者肝移植的機(jī)會［2］。闡明HCC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對于防治肝癌有著重要的意義。研究表明，表觀遺傳學(xué)的改變對腫瘤的診斷和治療有重大意義［3-4］，大量的證據(jù)表明DNA或者組蛋白甲基化導(dǎo)致的抑癌基因轉(zhuǎn)錄沉默與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。SETDB2是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可使組蛋白H3第9位賴氨酸殘基（H3K9）發(fā)生三甲基化（H3K9me3），其包含1個分成兩段的SET區(qū)域、1個前置的SET區(qū)域和1個甲基化的CpG結(jié)合區(qū)域，可通過抑制成纖維細(xì)胞生長因子8（FGF8）的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控石斑魚胚胎發(fā)育［6］。最新研究表明SETDB2在胃癌中高表達(dá)，并通過沉默抑癌基因WWOX和CADM1促進(jìn)胃癌的侵襲遷移［7］，但SETDB2在肝癌中的表達(dá)水平以及對肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制并不清楚。本研究旨在闡明SETDB2對肝癌侵襲遷移的影響及其分子機(jī)制，為肝癌的防治提供新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例標(biāo)本 收集2017年1月—6月我院手術(shù)切除的37例肝癌及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，經(jīng)病理學(xué)檢查，所有癌組織標(biāo)本均確診為HCC，癌旁組織標(biāo)本為正常肝組織。所有患者術(shù)前均未接受放化療，其中男29例，女8例，平均年齡（53.4±2.5）歲，標(biāo)本收集后立即液氮保存或者浸泡在10%福爾馬林溶液中。標(biāo)本均由患者本人知情同意并通過南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審核同意后收集。

1.1.2 細(xì)胞及試劑 肝癌細(xì)胞株MHCC97H購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。即用型免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。LipofectaminTM3000、Trizol試劑購自Invitrogen公司（美國）；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自TAKARA生物工程有限公司；Transwell小室購買于Corning公司（美國）；靶向SETDB2的短發(fā)卡RNA（sh-SETDB2）和靶向PTEN的短發(fā)卡RNA（sh-PTEN）及對應(yīng)的空載體對照質(zhì)粒均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。兔抗人SETDB2和PTEN多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人H3K9me3多克隆抗體以及SimpleChIP?Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Proteintech。羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SETDB2、PTEN和GAPDH引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Western blot法檢測蛋白的表達(dá) 將收集的肝癌組織、癌旁組織和培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞用RIPA裂解液（含PMSF）裂解后提取細(xì)胞總蛋白。制備的蛋白樣本經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，然后以260 mA恒流電轉(zhuǎn)移2 h將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。室溫下在含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h；加入1∶500稀釋的一抗（SETDB2、PTEN、H3K9me3和GAPDH），4℃反應(yīng)過夜；TBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗（1∶10 000），室溫下反應(yīng)l h；再次用TBST漂洗3次，每次10 min，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影成像，ECL發(fā)光系統(tǒng)曝光檢測。采用Image J分析所得圖像，SETDB2/GAPDH、PTEN/GAPDH和H3K9me3/GAPDH灰度比值分別表示SETDB2、PTEN和H3K9me3蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測組織蛋白表達(dá) 采用免疫組化EnVision兩步法。將浸泡在10%福爾馬林的肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織用石蠟包埋，然后按照3～4 μm厚度組織切片，經(jīng)過脫蠟、梯度乙醇水化、PBS清洗、抗原修復(fù)等過程后，滴加SETDB2抗體，孵育，滴加增強(qiáng)復(fù)合物和二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗后，DAB試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水，二甲苯透明30 min，中性樹膠和蓋玻片封片。用奧林巴斯顯微鏡采集圖像，以PBS作為陰性對照，同時設(shè)空白對照，已知陽性片作為陽性對照，根據(jù)染色程度判定SETDB2蛋白的表達(dá)情況，染色越強(qiáng)，表達(dá)越高。肝癌組織中SETDB2表達(dá)強(qiáng)于癌旁組織的病例納入為高表達(dá)組，低于癌旁組織的病例納入為低表達(dá)組。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA表達(dá)情況 Trizol法分別提取肝癌組織、癌旁組織和培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中的RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃ 5 s）。然后以cDNA為模板應(yīng)用SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RnaseH Plus）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。SETDB2引物：上游5'-CCATTTCACAGGCGAT?GCAA-3'，下游5'-GGTGGCAGACCCATCTTTGA-3'；PTEN引物：上游5'-TGTAAAGCTGGAAAGGGACGA-3'，下游5'-GGGAATAGTTACTCCCTTTTTG-3'；GAPDH引物：上游5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'，下游5'-GCGCCCAATAC?GACCAAATC-3'。使用 2-ΔΔCt分析法分析 SETDB2、PTEN mRNA的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 sh-SETDB2質(zhì)粒和sh-PTEN質(zhì)粒及對應(yīng)的空載體對照質(zhì)粒的提取 取少量靶向SETDB2的短發(fā)卡RNA（shSETDB2）質(zhì)粒和靶向PTEN的短發(fā)卡RNA（shPTEN）質(zhì)粒及對應(yīng)的空載體對照質(zhì)粒的菌液接種于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱內(nèi)搖晃8 h，先小量擴(kuò)增菌液，然后再倒入500 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱內(nèi)搖晃過夜，大量擴(kuò)增菌液。按照質(zhì)粒提取試劑盒的說明書步驟提取質(zhì)粒，備用。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的構(gòu)建 將MHCC97H細(xì)胞接種于6 cm2培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長到70%時換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑操作說明分別將20 μg空載體質(zhì)粒（shNC）和20 μg shSETDB2轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，靜置6 h后換有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，用遺傳霉素（G418）篩選陽性克隆；挑選陽性的單克隆細(xì)胞簇，在低劑量G418的條件下將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，同時采用Western blot和Realtime PCR法對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的細(xì)胞記為shNC-MHCC97H，轉(zhuǎn)染shSETDB2質(zhì)粒的細(xì)胞記為shSETDB2-MHCC97H。

1.2.6 Tanswell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力 取對數(shù)生長期的shNC-MHCC97H和shSETDB2-MHCC97H細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并計數(shù)后，取約1×105個細(xì)胞加入Transwell小室，用不含血清的培養(yǎng)液在5%CO2、37℃封閉環(huán)境下孵育36 h，甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗3～5遍。顯微鏡下計數(shù)穿到濾膜外表面的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞數(shù)越多說明細(xì)胞的侵襲能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力 制備shNCMHCC97H和shSETDB2-MHCC97H細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后種植約5×105個細(xì)胞于6孔板中，培養(yǎng)過夜后細(xì)胞均勻成單層鋪滿于每孔中，用相同大小槍頭進(jìn)行劃痕，每孔劃痕粗細(xì)均勻，PBS清洗劃下的細(xì)胞，添加不含血清的培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下于劃痕后0 h和24 h拍照，測量劃痕的寬度，計算細(xì)胞愈合率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度，愈合率越高表示細(xì)胞的遷移能力越強(qiáng)。

1.2.8 基因芯片實(shí)驗(yàn) 取1×107個shNC-MHCC97H和shSETDB2-MHCC97H細(xì)胞，用Trizol將細(xì)胞裂解后送樣至上海康成生物工程有限公司行轉(zhuǎn)錄組測序，在2組細(xì)胞中測序結(jié)果有差異的基因制作成熱圖。

1.2.9 染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP） 取對數(shù)生長期的1×108個shNC-MHCC97H和shSETDB2-MHCC97H細(xì)胞，以IgG和H3K9me3做免疫共沉淀，按照SimpleChIP?Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得染色質(zhì)用針對PTEN啟動子區(qū)域DNA序列的引物進(jìn)行Realtime PCR定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用配對t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間多重比較用Tukey法，分類資料的統(tǒng)計分析采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中SETDB2的蛋白及mRNA表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示：在肝癌組織中SETDB2的蛋白表達(dá)高于癌旁組織；Real-time PCR的結(jié)果顯示：肝癌組織中SETDB2 mRNA的相對表達(dá)量高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

2.2 SETDB2的表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 SETDB2表達(dá)的高低與肝癌組織學(xué)分級和TNM分期有關(guān)，而與年齡及術(shù)前甲胎蛋白（AFP）水平無關(guān)，見表2。

Tab.1 The expression of SETDB2 in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues表1 SETDB2在肝癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況（n=37，±s）

Tab.1 The expression of SETDB2 in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues表1 SETDB2在肝癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況（n=37，±s）

＊＊P＜0.01

組別癌旁肝癌t SETDB2蛋白表達(dá)量0.557±0.051 1.254±0.073 7.770＊＊SETDB2 mRNA表達(dá)量0.271±0.067 0.731±0.048 5.552＊＊

Tab.2 Relationship between SETDB2 expression and clinicopathological features表2 SETDB2的表達(dá)情況與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 穩(wěn)定干擾SETDB2細(xì)胞的構(gòu)建 Western blot檢測shNC組和shSETDB2組SETDB2的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，相比于shNC質(zhì)粒，shSETDB2質(zhì)粒可有效降低細(xì)胞中SETDB2的蛋白表達(dá)；熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況顯示兩種質(zhì)粒均已轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)，見圖1。

2.4 降低SETDB2的表達(dá)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力下降 Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shSETDB2-MHCC97H組細(xì)胞穿過小匙的數(shù)量少于shNCMHCC97H，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2A、表3。而劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，shSETDB2-MHCC97H細(xì)胞的愈合率低于shNC-MHCC97H細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2B、表3。

2.5 SETDB2上調(diào)PTEN的表達(dá) 基因芯片結(jié)果顯示，下調(diào)SETDB2的表達(dá)后，PTEN的mRNA表達(dá)水平升高，此外β-catenin及其下游某些靶基因如MMP-2、MMP-7、C-myc和CyclinD1表達(dá)下調(diào)，見圖3A。Western blot和Real-time PCR結(jié)果同樣顯示，下調(diào)SETDB2的表達(dá)導(dǎo)致PTEN的蛋白和mRNA表達(dá)增加，見圖3B、表4。

Fig.1 shSETDB2 plasmids can effectively reduce the expression of SETDB2 in MHCC97H cells圖1 shSETDB2質(zhì)粒可有效降低MHCC97H細(xì)胞中SETDB2的表達(dá)

Fig.2 The invasion and migration capacity declined in shSETDB2-MHCC97H cells圖2 shSETDB2-MHCC97H細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降

Tab.3 Results of Tanswell invasion assay and W oundhealing assay表3 Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=3，±s）

Tab.3 Results of Tanswell invasion assay and W oundhealing assay表3 Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別shNC-MHCC97H shSETDB2-MHCC97H t穿過小匙的細(xì)胞數(shù)量（個）103.700±4.410 43.330±3.756 10.420＊＊細(xì)胞的愈合率（%）50.8±4.9 23.0±3.6 4.542＊＊

Fig.3 Reduced SETDB2 up-regulated PTEN expression圖3 下調(diào)SETDB2導(dǎo)致PTEN表達(dá)上調(diào)

Tab.4 Expression levels of SETDB2 and PTEN m RNA表4 SETDB2與PTEN m RNA的表達(dá)量

2.6 shSETDB2導(dǎo)致PTEN基因的啟動子區(qū)域H3K9me3水平下調(diào) Western blot結(jié)果顯示，下調(diào)SETDB2導(dǎo)致H3K9me3水平下降，見圖4。CHIP結(jié)果顯示，下調(diào)SETDB2后PTEN基因的啟動子區(qū)域的H3K9me3減少，見表5。

Fig.4 The reduced expression of SETDB2 down-regulated the level of trimethylation of H3K9圖4 降低SETDB2的表達(dá)使H3K9的三甲基化水平下調(diào)

Tab.5 The CHIP results of IgG and H 3K 9me3表5 IgG和H 3K 9me3 CHIP結(jié)果

2.7 PTEN是SETDB2調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲能力的關(guān)鍵因子 在穩(wěn)定敲低SETDB2表達(dá)的MHCC97H細(xì)胞中同時敲低PTEN的表達(dá)，應(yīng)用Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)：與敲低SETDB2組相比，在敲低SETDB2的同時敲低PTEN表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲能力恢復(fù)，見圖5。

Fig.5 PTEN is a key factor for SETDB2 regulating the invasion ability of hepatoma cells圖5 PTEN是SETDB2調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲能力的關(guān)鍵因子

3 討論

組蛋白是組成核小體的核心部分，可以受多種共價修飾，如甲基化、乙酰化、磷酸化等；其中，組蛋白H3（Histone H3）的賴氨酸發(fā)生甲基化與基因轉(zhuǎn)錄的激活或者沉默密切相關(guān)［8］。一般來說，H3K9的三甲基化與基因轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)［9］。催化組蛋白發(fā)生甲基化的蛋白質(zhì)叫甲基轉(zhuǎn)移酶，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶通常都具有SET結(jié)構(gòu)域。研究已經(jīng)表明，SETDB1（SET domain，bifurcated 1）具有催化 H3K9甲基化的作用［10］，且其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用也已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)報道［11-13］。然而，SETDB1的同源蛋白SETDB2對腫瘤的作用仍不清楚，尤其是在肝癌中的表達(dá)情況及其作用，目前少有研究。本研究發(fā)現(xiàn)SETDB2基因在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且降低SETDB2表達(dá)可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力下降，雖然還缺少更多的樣本量驗(yàn)證以及對SETDB2的表達(dá)與肝癌預(yù)后的風(fēng)險進(jìn)行評估，但是這些結(jié)果表明SETDB2可能促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。腫瘤的分型、分級和分期是目前評價腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)后的最重要的三項(xiàng)指標(biāo)，其中組織學(xué)分級是反映生物學(xué)行為和侵襲轉(zhuǎn)移能力的內(nèi)在參數(shù)，腫瘤的TNM分期是反映腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的臨床可觀察參數(shù)。本研究分析SETDB2表達(dá)與肝癌臨床病理特征發(fā)現(xiàn)SETDB2與肝癌組織學(xué)分級和TNM分期有關(guān)。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致肝癌患者死亡的主要原因，許多抗腫瘤藥物都是針對阻斷肝癌的轉(zhuǎn)移而發(fā)揮抗癌作用，最經(jīng)典的藥物就是索拉菲尼；但是索拉菲尼的有效率僅為20%左右［14］。仍然有大部分患者沒有特異的靶向藥物治療。本研究的結(jié)果表明SETDB2可以促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，為肝癌的治療提供了一個新的靶向治療靶點(diǎn)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多基因、多因素的過程，與癌基因激活、抑癌基因沉默有密切關(guān)系［15］。研究表明，抑癌基因PTEN在胰腺癌、肝癌等腫瘤中低表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用［16-17］。然而，對PTEN表達(dá)的調(diào)控仍不是很清楚。本研究結(jié)果顯示SETDB2通過調(diào)控PTEN的表達(dá)進(jìn)而影響肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，基因芯片結(jié)果還顯示敲低SETDB2不僅使PTEN上調(diào)，還會使β-catenin及其下游靶基因C-myc、CyclinD1等下調(diào)，這與PTEN可抑制Wnt/β-catenin信號通路的研究結(jié)論是一致的［18］。

雖然SETDB2蛋白包含有SET結(jié)構(gòu)域，被定義為甲基轉(zhuǎn)移酶，但是仍少有證據(jù)表明SETDB2對H3K9me3的影響。本研究發(fā)現(xiàn)敲低SETDB2的表達(dá)使H3K9me3水平下降，應(yīng)用CHIP實(shí)驗(yàn)證明，在PTEN的啟動子區(qū)域的H3K9me3也是下降的。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明SETDB2是通過組蛋白修飾從而抑制PTEN的表達(dá)。

在本研究中，通過檢測肝癌組織中SETDB2的表達(dá)以及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明SETDB2在肝癌中高表達(dá)并促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移；此外，基因芯片和CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB2是通過影響PTEN的啟動子區(qū)域的H3K9me3水平進(jìn)而抑制PTEN的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用，為肝癌的防治提供了一個新的靶點(diǎn)。