富含脯氨酸蛋白11在膽囊癌組織中的表達及意義

蘇寶威，白明輝，劉海潮

膽囊癌是指發生于膽囊體、底、頸及膽管的惡性腫瘤，是膽道系統常見的惡性程度較高的腫瘤，發病率在消化系統惡性腫瘤中高居第6位［1］。膽囊癌發病率地域差別大，且與人種有關，亞洲及拉美地區高發；近年來，我國膽囊癌的發病率呈增高趨勢。膽囊癌惡性程度高，整體5年生存率＜5.0%，中位生存期＜6個月［2］。目前延長膽囊癌患者生存期的唯一有效方法是根治性切除［3］，但膽囊癌早期癥狀缺乏特異性，診斷時大多已是中晚期，只有＜25%可切除，且50%左右出現淋巴結轉移［1］，預后極差［4-5］。因此能否早期診斷膽囊癌就尤為重要，近年來已有較多研究尋找膽囊癌的生物學標志物，期望能為早期診斷膽囊癌并改善其預后提供幫助［6］。富含脯氨酸蛋白11（proline-rich protein 11，PRR11）已被證實在多種腫瘤如肺癌、胃癌、胰腺癌及骨肉瘤等中發揮作用，且參與調節細胞周期進程［7］，但目前鮮見有PRR11與膽囊癌關系的研究。本研究試圖分析膽囊中PRR11的表達情況以探討其與膽囊癌發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 為鄭州大學附屬洛陽中心醫院2014年10月—2017年10月手術切除的標本，經病理證實膽囊癌組58例，其中男28例，女30例，年齡32～84歲，中位年齡56.7歲。組織學類型分類：腺癌48例，鱗癌10例。Nevein分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期19例，Ⅴ期13例。病理分級：高分化癌14例，中分化癌21例，低分化癌23例。淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移20例。所有標本納入標準：膽囊癌患者均無腫瘤病史，術前未接受化療、放療及生物治療等，其病歷資料完整。隨機選取同期慢性膽囊炎49例作為對照組。兔抗人PRR11單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，S-P試劑盒，磷酸鹽緩沖液（PBS），DAB顯色試劑盒和抗原修復液均購自福州邁新生物技術開發有限公司。其他設備及試劑由鄭州大學附屬洛陽中心醫院中心實驗室及病理科提供。

1.2 免疫組化SP法染色 取所有標本的石蠟切片（4 μm厚），常規脫蠟水化，PBS洗滌5 min，修復抗原：枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸2 min，7 min后自然冷卻到室溫，PBS清洗3次；3%H2O2室溫下浸泡10 min，阻斷內源性過氧化物酶，室溫下孵育30 min，PBS洗滌3次；10%山羊血清封閉抗原90 min；加入兔抗人PRR11多克隆抗體4℃過夜；室溫下復溫30 min，PBS洗滌3次；加辣根過氧化物標記過的羊抗兔IgG（稀釋度1∶500），37 ℃反應45 min，PBS洗滌3次；加入S-A-HRP工作液于濕盒中37℃反應40 min，PBS洗滌3次；DAB顯色，PBS洗滌3次；蘇木素復染2 min，PBS洗滌3次。梯度乙醇脫水透明后封片。用已知陽性標本作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定 每張切片均由兩位經驗豐富的病理科醫生采用雙人盲法閱片讀取結果。PRR11表達陽性細胞在膽囊癌中呈棕褐色或（和）棕黃色，主要定位于細胞質，采用陽性細胞計數與染色強度相結合的二級計分法對PRR11蛋白陽性表達結果進行判定［8］。著色強度為0級（無著色/-）計0分，1級（黃色/+）計1分，2級（棕黃色/++）計2分，3級（棕褐色/+++）計3分。陽性細胞百分比≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。總分由陽性細胞百分比及著色強度兩項計分相乘所得，總分＜4分為陰性，總分≥4分為陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，3組間多重比較時P＜0.017為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PRR11在膽囊癌、癌旁組織及慢性膽囊炎組織中的表達 PRR11主要表達于細胞質中，陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色分布，見圖1。膽囊癌組織、癌旁組織和慢性膽囊炎組織中PRR11陽性表達率分別為55.2%（32/58）、25.9%（15/58）和4.1%（2/49），膽囊癌組織中PRR11陽性表達率高于癌旁組織、慢性膽囊炎組織，差異均有統計學意義（χ2分別為10.337、26.504，均P＜0.01）。

2.2 PRR11表達與膽囊癌臨床病理指標之間的關系 不同年齡、性別、組織學類型分組膽囊癌患者癌組織中PRR11陽性表達率比較差異無統計學意義，臨床分期Ⅲ～Ⅴ期組陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期組，病理分級中低分化組陽性表達率高于高分化組，有淋巴結轉移組陽性表達率高于無淋巴結轉移組，差異均有統計學意義，見表1。

Tab.1 Relationship between PRR11 expression and clinicopathological parameters of gallbladder carcinoma表1 PRR11表達與膽囊癌臨床病理指標的關系 例（%）

3 討論

Fig.1 Immunohistochemical detection of PRR11 expression(×200)圖1 不同組織免疫組化檢測PRR11的表達（×200）

PRR11基因是新發現的一種參與細胞周期調控、與腫瘤發生發展相關的基因，位于人染色體17q22，由9個內含子和10個外顯子組成，翻譯起始密碼子位于第2個外顯子，終止密碼子位于最后1個外顯子［9］，該基因與目前發現的腫瘤相關基因BRIP1、RPS6KB1、PPM1D 及 TRIM37等共同位于17q22區，其編碼的蛋白分子質量為40 ku，含360個氨基酸，有1個二聯核定位信號，1個鋅指結構域和2個脯氨酸富集區域。目前認為，惡性腫瘤的生物學特征是腫瘤細胞的失控性生長，而其根本原因是細胞周期的調控紊亂［10］。研究表明，敲除PRR11可阻滯細胞周期在S期，PRR11下調表達也導致細胞阻滯在G2期，從而抑制細胞進入有絲分裂，阻滯細胞DNA的合成和有絲分裂的正常進行，使細胞周期發生紊亂［11］，因此推測PRR11在腫瘤的發生發展過程中有非常重要的作用。

本研究顯示結果發現，58例膽囊癌組織中PRR11呈陽性表達的有32例，陽性率高達55.2%，明顯高于其在癌旁組織（25.9%）和慢性膽囊炎組織（4.1%），Nevein分期Ⅲ～Ⅴ期組PRR11陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期組，提示PRR11在膽囊癌的發生過程中起一定作用。PRR11在中低分化癌組織中的表達（65.9%）顯著高于其在高分化癌組織中的表達（21.4%），推測PRR11促進了膽囊癌的惡性生物學行為。此外PRR11蛋白的陽性表達率在有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組，提示其可能增強了膽囊癌的浸潤侵襲能力。而PRR11在膽囊癌組織中的表達與膽囊癌患者的性別、年齡等無關；這與PRR11在肺癌和胰腺癌［11-12］中的表達一致。宋宗昌等［13］研究發現PRR11表達下調可以顯著抑制胃癌HGC-27細胞的增殖和侵襲能力，并可導致其侵襲相關蛋白cyclinD1蛋白和基質金屬蛋白酶（MMP）-2蛋白表達下降。張小軍等［14］研究顯示，通過下調人骨肉瘤細胞SaOS2中PRR11的表達，可使G0～G1期的細胞比例明顯增大，而S期細胞比例明顯減少，推測PRR11蛋白推動骨肉瘤細胞從S期向G2/M期轉換，導致細胞異常增殖，聯合張春東等［11］的研究可見PRR11對細胞周期的調控是多方面的。因此PRR11不僅對腫瘤的發生發展及細胞周期有影響，而且還可誘導腫瘤侵襲相關蛋白的表達，增強腫瘤細胞惡性生物學行為。另有研究提示敲除PRR11還可以使參與細胞周期、腫瘤形成和轉移關鍵通路中的重要基因如RRM1、EPB41L3、CCNA1和MAP4K4等表達下調，共同影響腫瘤形成的過程［15］。當然影響膽囊癌的發生、發展、浸潤及轉移的因素非常復雜，影響細胞周期的因素也很多，PRR11只是其中之一。

綜上所述，PRR11與膽囊癌的發生、發展及侵襲等密切相關，但PRR11對腫瘤調控的機制非常復雜，具體還需進一步研究。