DNA-微陣列芯片法檢驗結核與非結核分枝桿菌的臨床應用價值

徐微

吉林省結核病醫院檢驗科，吉林長春 130500

非結核分枝桿菌是指結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌與牛分枝桿菌以外的分枝桿菌，其特征與結核分枝桿菌有明顯差異，現已備受各界學者的關注[1]。目前，臨床主要通過抗酸染色法、羅氏法等進行結核與非結核分枝桿菌診斷，然而抗酸染色法鑒別效果較差，羅氏法雖然準確率較高，但檢驗時間長、操作復雜，無法為患者早期診療工作提供保障[2]。因此，探尋一種快速、準確的檢驗方法鑒別各類型分支桿菌十分必要。該研究隨機選擇2016年12月—2018年3月該院痰結核培養或結核分枝桿菌痰涂片陽性標本108份，采用博奧生物有限公司生產的DNA-微陣列芯片法進行檢驗，并與改良羅氏法與測序法對比，探討DNA-微陣列芯片法對結核與非結核分枝桿菌的鑒別價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇該院痰結核培養或結核分枝桿菌痰涂片陽性標本108份，其中痰培養陽性48份，痰涂片陽性60份。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 主要儀器：E-Cycler96梯度PRC儀，BioMixerII芯片雜交儀，Extractor36核酸快速提取儀，Luxscan10K-B微陣列芯片掃描儀。試劑：噻吩-2-羧酸肼、對硝基苯甲酸與改良羅氏培養基均由天津金章科技發展有限公司提供，DNA-微陣列芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒由北京博奧生物有限公司提供。

1.2.2 檢驗方法 108份標本均采用改良羅氏培養法、DNA-微陣列芯片法檢驗，對二者檢驗結果不一致的標本進行測序，并將結果作為檢驗的金標準。⑴改良羅氏培養法：通過對硝基苯甲酸生長實驗初步鑒定菌種，識別出的結核分枝桿菌菌株，并以絕對濃度法給予分枝桿菌藥物敏感檢驗。試驗方法根據中國防癆協會制定的 《結核病診斷實驗室檢驗規程》執行。⑵DNA-微陣列芯片法檢驗：根據試劑說明書中的標準進行相關操作。①核酸提取：選取核酸提取液80 μL并置于提取管中，加入無菌接種環挑取的涂片陽性痰液或培養陽性菌落。通過核酸快速提取儀進行震蕩，時間為5 min，再以90℃水浴 5 min，速度5 000 rpm離心1 min，取出核酸放置在-20℃的冰箱內待檢。②PCR擴增：在每個樣品上設置3個復孔，并實施擴增反應。在200 μL離心管內加入PCR擴增試劑1～3各18 μL，并在3個離心管內加入包含待檢樣品DNA的核酸提取管內上清液2 μL，放置在PCR擴增儀中，根據說明書內的熱循環流程給予PCR擴增。PCR引物序列均由博奧生物有限公司提供，其中PCR擴增試劑1～3擴增分別為分枝桿菌屬探針序列，rpoB基因突變位點序列，inhA與katG基因突變位點序列。③芯片雜交：加熱雜交緩沖液，溫度控制在50℃，待其完全融化合混勻后，分別取9 μL放置在2管內。各取3 μL PCR1與2產物加入上述2個雜交緩沖液管內，配制成混合物R。各取3 μL PCR1與3產物配制混合物H。加熱雜交混合物，溫度為95℃，使其變性5 min，之后冰浴3 min。在加樣孔內加入13.5 μL混合物，微陣列1加入混合物R，微陣列2加入H，密封放置在溫水（50℃）浴鍋內120 min。④洗滌與干燥：拆開雜交盒，取出芯片放置在包含芯片洗滌液Ⅰ的容器內，以80～100 rpm的速度恒溫振蕩，洗滌3 min。之后以80～100 rpm的速度恒溫振蕩芯片洗滌液Ⅱ，洗滌3 min。最后將芯片放置在離心機內，以800 rpm的速度離心5 min，甩干后掃描。⑤掃描與結果讀取：通過微陣列芯片掃描儀與相關軟件讀取信號與結果。⑶測序：將改良羅氏培養與DNA-微陣列芯片法檢驗不一致的標本進行DNA序列檢驗，利用博奧生物有限公司生產試劑盒中的引物作為測序上下游引物。

1.3 觀察指標

將測序結果作為金標準，評價改良羅氏法、DNA-微陣列芯片法對結核與非結核分枝桿菌的鑒別效果。改良羅氏培養法鑒別標準：選取羅氏培養基上單個菌落實施噻吩-2-羧酸肼與對硝基苯甲酸檢驗，當噻吩-2-羧酸肼（+），對硝基苯甲酸（-）時為結核分枝桿菌；當噻吩-2-羧酸肼（+），對硝基苯甲酸（+）時為非結核分枝桿菌。DNA-微陣列芯片法鑒別標準：按照芯片上探針在特定位置的排布，讀取受檢細胞的信息，繼而鑒定出分枝桿菌菌種。

1.4 統計方法

該研究數據采用SPSS 15.0統計學軟件分析，計數資料采用[n（%）]表示，以 χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

108份標本經測序結果顯示，結核分枝桿菌26份，非結核分枝桿菌82份。經改良羅氏培養法檢驗，鑒定為結核分枝桿菌25份，非結核分枝桿菌80份；經DNA-微陣列芯片法檢驗，鑒定為結核分枝桿菌24份，非結核分枝桿菌79份，其中包括戈登分枝桿菌16份，胞內分枝桿菌30份，堪薩斯分枝桿菌10份，偶然分枝桿菌5份，復合群鳥分枝桿菌10份，無法讀取8份。經改良羅氏培養法檢驗對結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌的準確率為96.15%、97.56%，與DNA-微陣列芯片92.31%、96.34%對比差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 改良羅氏法、DNA-微陣列芯片法對結核與非結核分枝桿菌的鑒別效果對比[n（%）]

3 討論

分枝桿菌屬于細菌的一大類，其包含不同的細菌菌種，結核分枝桿菌可導致人類罹患結核病，非結核分枝桿菌則是分枝桿菌類目下的細菌，不是導致結核病的原因[3]。近年來，非結核分枝桿菌的感染率顯著攀升，且感染種類也不斷增加，現已備受臨床學者的關注[4]。由于致病性非結核分枝桿菌感染與結核病癥狀相似，均存在全身癥狀與局部損害，且二者影像學表現十分相近，極易發生誤診，延誤治療時機[5]。

目前，改良羅氏法是鑒別結核與非結核分枝桿菌的主要檢驗方法，可以直觀觀察到細菌的生長。然而，部分研究發現，改良羅氏法易受菌齡、菌量與受檢者主觀因素的影響，加之檢驗周期長（通常從患者就診到獲取到敏感結果需要2～3個月）、操作復雜，無法為患者提供早期診斷依據[6-7]。目前，分子生物學技術是熱門的快速檢驗方法。DNA-微陣列芯片法與線性探針相似，其技術特點是通過設計PCR擴增引物與寡核苷酸探針，在芯片表現上固定，并經與針對性擴增受檢樣本的DNA片段雜交，利用芯片掃描儀對雜交后的芯片熒光信號進行掃描，繼而讀取出菌種信息[8]。同時，DNA-微陣列芯片可在6 h得出檢驗結果，操作簡單、快速，并能夠同時鑒別17種分枝桿菌，有效保證了患者的治療時機。學者何建[9]對125例結核分枝桿菌痰涂片陽性標本與傳統培養結核分枝桿菌陽性標本，應用了DNA微陣列芯片法檢測耐藥性，結果發現該方法對異煙肼耐藥的一致率為98.8%，對利福平的一致率為99.4%，并認為DNA微陣列芯片檢測結核分枝桿菌的耐藥性效果可靠，且用時短，可用于臨床篩查。學者何莉等[10]對64例改良羅氏法陽性分枝桿菌核酸應用了DNA-微陣列芯片法檢測，并以測序法作為金標準，結果顯示兩種方法檢測的一致率為93.8%，非結核分枝桿菌一致率95.8%，結核分枝桿菌一致率87.5%。該文研究結果與上述結果相符，改良羅氏培養法對結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌檢驗的準確率為96.15%、97.56%，與DNA-微陣列芯片92.31%、96.34%對比差異無統計學意義（P＞0.05）。 可見，DNA-微陣列芯片與改良羅氏法鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌的效果相當，但DNA-微陣列芯片的檢驗速度更快，為臨床診療提供了有利的參考。108份標本中，DNA-微陣列芯片菌種顯示無法讀取5份，其中4份樣本在偶然分枝桿菌熒光探針處肉眼觀察到微弱的熒光信號，但因背景過亮，干擾了信號值的讀取；1份樣本不僅背景過亮，且熒光存在雜質，導致熒光信號極弱。究其原因可以與以下幾項有關：①開始加樣-干燥芯片的某個環節中，芯片微陣列液體直接暴露在空氣中過久，樣本過于干燥而提高了芯片背景亮度；②實驗樣本受到污染，導致芯片背景存在雜質；③核酸濃度差異對結果讀取造成了干擾[10]。

綜上所述，DNA-微陣列芯片法在結核與非結核分枝桿菌檢驗中具有較高的準確率，且操作簡單、快速，臨床應用價值顯著，適于推廣。