糖腎方顆粒不同制備工藝治療UUO小鼠腎間質纖維化的藥效學研究

劉言振 劉鵬 趙婷婷 張浩軍 趙海玲 嚴美花 陳嬌伊 李丹丹 孫建波 李平

摘要 目的：利用單側輸尿管梗阻模型小鼠篩選糖腎方顆粒的最佳制備工藝。方法：根據(jù)大孔樹脂富集、醇提、水提方法設計糖腎方制備工藝1、2、3組。選用C57BL/6小鼠，隨機分為假手術組，模型組，工藝路線1、2、3組，陽性藥福辛普利組，連續(xù)給藥6d后，進行單側輸尿管結扎手術。手術后再連續(xù)給藥7d，檢測小鼠血清肌酐和尿素氮，根據(jù)MASSON染色半定量分析各組小鼠的腎間質纖維化，根據(jù)HE染色進行腎間質細胞浸潤評分。結果：各工藝路線組均對UUO引起的小鼠腎病理損傷有一定的改善作用，均顯著改善腎間質纖維化，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中工藝路線1、3組作用更佳。工藝路線3組能顯著改善小鼠UUO后的血肌酐和尿素氮水平，顯著減少腎間質細胞浸潤，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：糖腎方顆粒的制備工藝確定為水提工藝。

關鍵詞 糖腎方；腎間質纖維化；制備工藝篩選；UUO

AbstractObjective：Toselecttheoptimalpreparationprocessofsugar-basedkidneygranulesinunilateralureteralobstructionmodelmice.Methods：Accordingtomacroporousresinenrichment，alcoholextractionandwaterextractionmethods，thepreparationprocessofTangshenFormulaI，IIandIIIweredesigned.C57BL/6micewererandomlydividedintoshamoperationgroup，modelgroup，routeI，IIandIIIgroups，andpositivedrugfosinoprilgroup.Sixdaysaftercontinuousadministration，unilateralureteralligationwasperformed.Sevendaysaftersurgery，miceweregivenserumcreatinineandureanitrogenfor7days.SemiquantitativeanalysisofrenalinterstitialfibrosisineachgroupwasperformedaccordingtoMASSONstaining.RenalinterstitialcellinfiltrationscoreswereevaluatedbyHEstaining.Results：EachroutegrouphadacertainimprovementonthepathologicaldamageofkidneyinducedbyUUOinmice，allofwhichsignificantlyimprovedrenalinterstitialfibrosis（P<0.05）.Amongthem，thefirstandthirdgroupsoftheprocessroutehadbettereffects.ThethreeroutescansignificantlyimprovetheserumcreatinineandureanitrogenlevelsofmiceafterUUO，andsignificantlyreducerenalinterstitialcellinfiltration（P<0.05）.Conclusion：ThepreparationprocessofTangshenFormulawasdeterminedasthewaterextractionprocess.

KeyWordsTangshenFormula；Renalinterstitialfibrosis；Preparationprocessscreening；UUO

中圖分類號：R943.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.003

腎間質纖維化（RenalInterstitialFibrosis，RIF）是許多類型腎臟疾病的主要病理基礎，造成腎臟功能的不可逆損傷，同時在糖尿病腎病中腎間質纖維化促進病情進展，因此抑制RIF是保護腎臟的有效治療策略。中醫(yī)藥防治腎間質纖維化有其獨特的優(yōu)勢。糖腎方（TangShenFomula，TSF）是本課題組繼承前人經(jīng)驗，結合臨床實踐，以益氣養(yǎng)陰、活血通絡立法，組方而來。它是由黃芪，生地黃、山茱萸、三七、衛(wèi)矛、熟大黃、枳殼七味中藥組成的復方制劑。臨床試驗和基礎研究證明TSF可以較好的防治糖尿病腎病和改善腎間質纖維化[1-2]。本研究利用經(jīng)典的單側輸尿管梗阻（UnilateralUreteralObstruct，UUO）小鼠動物模型，對大孔樹脂富集、醇提以及水提工藝制備的糖腎方顆粒進行評價，以確定糖腎方最優(yōu)提取方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物實驗選用雄性C57BL/6小鼠，SPF級，8周齡，22～24g，共48只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2007-0001。在中日友好醫(yī)院動物室屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（京）2005-0019。實驗期間，小鼠自由進食、飲水。

1.1.2藥物糖腎方由黃芪、生地黃、三七、大黃、酒山萸肉、鬼箭羽及枳殼7味藥組成，草藥和最終粉末的原料進行質量控制，符合中華人民共和國2010年藥典規(guī)定的準則[2]。福辛普利片（蒙諾片）由施貴寶制藥有限公司提供，國藥準字（1998）第J-57號。

1.1.3試劑與儀器CD-1600全自動生化分析儀（美國，雅培公司），BX-51顯微鏡（日本，奧林巴斯公司），DP70圖形采集系統(tǒng)（日本，奧林巴斯公司），BS224S精密分析天平（德國，賽多利斯公司）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備48只小鼠按體重隨機分為假手術組（sham）、模型組（UUO）、模型+糖腎方工藝1組（TSF-1）、模型+糖腎方工藝2組（TSF-2）、模型+糖腎方工藝3組（TSF-3）以及模型+福辛普利組（Fosinopril）。采用單側輸尿管結扎方法建立單側輸尿管梗阻模型[3]，結扎小鼠左側輸尿管，假手術組小鼠輸尿管只游離不結扎。

1.2.2工藝選擇工藝路線1：三七、衛(wèi)矛、麩炒枳殼分別提取后經(jīng)大孔樹脂富集得到提取物①；熟大黃氨水處理后醇沉得到提取物②；黃芪、生地黃采取水提醇沉法得到提取物③；酒山萸肉采取乙醇回流提取工藝得到提取物④；合并提取物①②③④所得。工藝路線2：三七、酒山萸肉、熟大黃、衛(wèi)矛采取乙醇回流提取，得提取物①；黃芪、生地黃、麩炒枳殼采取水煎煮提取，得提取物②；合并提取物①②所得。工藝路線3：黃芪、生地黃、大黃、酒山萸肉、鬼箭羽及枳殼六味藥水煎煮2次，濃縮干燥，三七細粉混合加入過篩，得糖腎方顆粒提取物。

1.2.3給藥方法小鼠每日每克生藥用量為6.375mg/g/d。由于3種工藝出膏率不同，配置藥物濃度為：工藝一藥物濃度125.65mg/mL；工藝二藥物濃度168.49mg/mL；工藝三藥物濃度222.23mg/mL。根據(jù)小鼠體重，每天灌胃體積為：0.1mL/10g。福辛普利小鼠用藥量為1.5mg/（kg·d），即0.0015mg（g·d）。根據(jù)小鼠體重，每天灌胃體積：0.1mL/10g。配置的藥物濃度0.15mg/mL。空白組和模型組灌蒸餾水，體積：0.1mL/10g。

1.3標本采集手術后第7天，禁食給水，水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，分離血清，摘取腎取中間部分橫切后固定在10%中性甲醛溶液中進行組織病理學檢查。

1.4檢測指標與方法一般狀態(tài)：密切觀察動物毛色，反應性，手術切口愈合情況，有無感染。血生化指標：小鼠血清樣本使用全自動血生化分析儀來測定血清高密度脂蛋白膽固醇（High-densityLipoproteinCholes-terol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-densi-tyLipoproteinCholesterol，LDL-C）、肌酐（Creatinine，Cre）、尿素氮（BloodUreaNitro-gen，BUN）。組織病理學指標：腎臟組織用10%的中性甲醛溶液固定24h后，然后乙醇脫水，石蠟包埋后切片，厚度為3μm，分別進行HE染色、Masson染色，光鏡下觀察小鼠腎組織的病理形態(tài)學變化。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，進行單變量方差分析（One-WayANOVA），組間的兩兩比較選用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組小鼠一般狀態(tài)手術完成后，各組小鼠全部生存，手術切口愈合良好，未見感染征象。各組小鼠活動能力、毛色差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.23種制備工藝的糖腎方顆粒對UUO小鼠血清肌酐、尿素氮水平的影響與假手術組比，模型組血肌酐和尿素氮顯著升高。與模型組比較，糖腎方工藝3組可以顯著降低肌酐和尿素氮水平，工藝1組顯著降低肌酐水平，工藝2組顯著性降低尿素氮水平；陽性藥福辛普利的肌酐和尿素氮水平、工藝1組的尿素氮水平以及工藝2組的肌酐水平無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.33種制備工藝的糖腎方顆粒對UUO小鼠腎間質纖維化的影響每只小鼠左腎的Masson染色切片在光鏡200倍視野下分別觀察8個互不重疊的皮質視野，借助DP70圖形采集系統(tǒng)，計算纖維化的面積占全部視野間質面積（排除腎小球、血管所占面積）的百分比值，取其平均值，進行半定量分析。與假手術組比較，模型組纖維化面積顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，糖腎方3個工藝組和陽性藥福辛普利組均能顯著改善腎間質纖維化的程度，減輕小鼠腎小管壞死程度，其中以糖腎方工藝三效果最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），工藝1次之，工藝2最差。見圖2。

2.43種制備工藝的糖腎方顆粒對UUO小鼠腎組織形態(tài)學變化的影響在光鏡下觀察，假手術組左腎均未見明顯異常。模型組左腎在鏡下可見腎盂擴張，腎實質變薄、皮髓分界不清，腎盞可見斑痕。鏡下部分腎小管上皮細胞萎縮，消失，小管擴張；腎間質細胞細胞增多及炎性細胞浸潤，基質增多。見圖3。

2.53種制備工藝的糖腎方顆粒對UUO小鼠腎間質細胞浸潤的影響顯微鏡下盲法每只小鼠隨機取互不重疊的8個視野，按下列標準計量腎臟病理改變并分別進行腎間質細胞浸潤情況評分（CellInfiltrationScore，CIS）：間質細胞浸潤：無（0分）、局灶細胞浸潤（1分）、多灶細胞浸潤（2分）、彌漫細胞浸潤（3分）；取評分均值代表各樣品的腎間質細胞浸潤程度。與假手術組比較，模型組小鼠腎間質纖維化炎細胞顯著聚集，糖腎方的工藝1和工藝3組及福辛普利組均能夠改善腎間質的炎細胞聚集，其中以糖腎方工藝3組改善情況最為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3-4。

2.63種制備工藝的糖腎方顆粒對UUO小鼠血清HDL-C和LDL-C的影響與假手術組比較，模型組HDL-C顯著降低。與模型組比較，糖腎方工藝3和福辛普利組均顯著升高HDL-C水平，工藝1和工藝2差異無統(tǒng)計學意義。與假手術組比較，模型組LDL-C變化差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），糖腎方3個工藝各劑量和陽性對照藥對模型小鼠血清LDL-C水平無顯著影響。見圖5。

3討論

糖腎方作為本課題組繼承前人經(jīng)驗，結合臨床實踐組方，用于治療糖尿病腎病的中藥復方，前期開展的動物實驗和多中心RCT臨床試驗已經(jīng)證實了糖腎方治療DN療效確切[1-5]。在單側腎切合并鏈脲佐菌素注射誘導大鼠模型中[4]，糖腎方能降低尿白蛋白排泄，改善腎功能；顯著減輕模型大鼠的腎間質纖維化水平。

腎間質纖維化不僅是DN的病理基礎，也是諸多慢性腎臟病進展至慢性腎衰的必然途徑[6]。UUO模型是研究腎間質纖維化的常見模型，高度契合人類腎臟疾病過程，在相對較短的時間跨度內，基本上概括了典型的腎間質損傷纖維化形成的關鍵特征，是一種較為理想的腎間質纖維化藥效學評價模型[7]。本研究采用8周齡雄性C57BL/6小鼠進行UUO手術，7d后出現(xiàn)腎盂擴張、實質變薄、腎小管上皮細胞萎縮、消失，管腔明顯擴張、間質炎細胞大量聚集、Masson染色可見大量藍色膠原纖維增生、腎功下降[8]、脂代謝紊亂[9]等變化，高度吻合以往文獻報告的UUO模型病變特點[7]，表明模型建立成功。并在此基礎上進行糖腎方不同提取工藝的藥效學評價。結果表明工藝3顯著改善腎間質纖維化、減少腎間質炎細胞聚集、降低血肌酐和尿素氮水平且顯著升高模型小鼠血清HDL-C水平，提示其也有改善脂代謝異常的作用，主要改善了HDL-C水平，LDL-C水平未見明顯改變，在之前的研究中也發(fā)現(xiàn)了糖腎方能改善脂代謝的作用[10]。工藝1也能改善UUO小鼠的腎功和腎間質損傷，但不及工藝3。可能是因為醇沉工藝除去了相當部分的具有減輕腎間質損傷的活性多糖，如：黃芪中的皂苷、枳殼中的柚皮苷以及地黃中的梓醇[7]、橙皮苷等，使其藥效降低有關。研究發(fā)現(xiàn)工藝2改善腎損傷的作用不明顯，這可能與大黃醇提后有腎毒性蒽醌類[7，11]的溶出增加有關。

綜上所述，糖腎方在慢性腎臟病具有多重治療功效，對腎間質損傷也具有一定的治療作用，三七干粉加入其余6味藥水煎煮提取的工藝3，在改善UUO模型小鼠腎組織病理損害、減少腎間質炎細胞聚集、降低血肌酐尿素氮方面藥效顯著優(yōu)于工藝1和工藝2，為最佳提取工藝，故糖腎方顆粒提取工藝確定為三七細粉加入其余全方6味藥采取水煎煮提取，為糖腎方進一步的研究奠定了基礎。

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（2018-05-10收稿責任編輯：張文婷）