陜產瞿麥中總黃酮提取工藝響應曲面法的優化

張爽　劉治飛　高潔　問娟娟

摘要 目的：評價響應曲面法優選出超聲輔助提取陜產瞿麥中總黃酮類化合物的最優方案。方法：實驗以陜產瞿麥為原料，乙醇為提取劑，在單因素實驗的基礎上，通過響應面實驗對超聲輔助法提取陜產瞿麥中總黃酮的工藝進行優化。結果：優選出了超聲輔助提取陜產瞿麥中總黃酮的最佳工藝條件：液料比10倍、提取功率140W、乙醇濃度80%時，總黃酮的提取率最大可以達到0.851%。結論：工藝的實驗值與預測值基本相符，采用響應曲面法優選超聲輔助提取陜產瞿麥中黃酮類化合物的提取工藝穩定可行，為陜產瞿麥資源的開發和利用提供一定的參考依據。

關鍵詞 陜產瞿麥；黃酮類化合物；超聲提取；響應曲面法；單因素試驗；紫外可見分光光度法；工藝條件；提取率

AbstractObjective：ToselecttheoptimizedplanofultrasonicassistedextractingtotalflavonoidsinHerbaDianthifromShaanxibytheresponsesurfacemethod.Methods：Inthisexperiment，ShaanxiproducingHerbaDianthiwastakenasrawmaterial，andethanolasextractionagent.Onthebasisofsinglefactorexperiment，theextractionprocessoftotalflavonoidsfromHerbaDianthiofShaanxibyultrasonicassistedmethodwasoptimizedwiththeresponsesurfacemethod.Results：TheultrasonicassistedextractionconditionsoftotalflavonoidsinHerbaDianthifromShaanxiwereoptimized：liquidandmaterialratiowas10times，extractionpower140W，80%ethanolconcentration，andtheextractionrateofflavonoidscouldreach0.851%.Conclusion：Theprocessoftheexperimentalvaluesarebasicallyconsistentwiththepredictedvalue，indicatingusingresponsesurfacemethodologytooptimizeultrasonicassistedextractiontechnologyofflavonoidsinHerbaDianthiinShaanxiProvinceisstableandfeasible，andprovidingreferenceforthedevelopmentandutilizationofHerbadianthiresourcesinShaanxiProvince.

KeyWordsHerbaDianthiinShaanxiProvince；Flavonoids；Ultrasonicextraction；Responsesurfacemethod；Singlefactortest；UVvisiblespectrophotometry；Processconditions；Extractionrate

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.056

瞿麥又名野麥、石柱花、十樣景花等，為石竹科石竹屬植物瞿麥DianthussuperbusL.的干燥地上部分。瞿麥是我國常用的傳統中藥，性味苦、寒；歸心經、小腸經、膀胱經。具有清熱利水，破血通經之功效，主治小便不通、熱淋、血淋、砂石淋、目赤腫痛、經閉等癥[1]。現代藥理學的研究表明，瞿麥具有抗腫瘤、利尿、興奮子宮、抗菌、免疫調節作用、抗氧化作用、溶血作用等作用。其主要成分有皂苷類、環肽類、黃酮類、蒽醌類、有機酸類、揮發油類、生物堿類、維生素、色素及多糖等[2-3]。

響應曲面法是一種統計學試驗設計方法，該法通過建立連續變量曲面模型，對影響過程的因子及其交互作用進行評價，確定最佳水平，而且所需要的觀察組數相對較少，可節省人力物力。中藥有效成分復雜，有效成分含量相對較低，且在提取過程中會受到很多因素的影響，響應曲面法可以有效的優化中藥有效成分的提取工藝，其實驗次數少，可以在一定程度上縮短實驗周期[4]。本實驗以陜產瞿麥作為研究對象，采用響應曲面法對超聲波輔助提取陜產瞿麥中的活性成分總黃酮進行了工藝的優化。以期為陜產瞿麥中黃酮類化合物的提取及陜產瞿麥資源的進一步開發和利用提供一定的理論依據。

1材料與儀器

1.1實驗材料瞿麥（陜西省眉縣藥材總公司，經陜西國際商貿學院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為石竹科植物瞿麥DianthussuperbusL.的帶花全草）；蘆丁標準品（中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（分析純）；亞硝酸鈉（分析純）；氫氧化鈉（分析純）。

1.2實驗儀器微波萃取儀XH100B（北京詳鋯發展有限公司）；高速萬能粉碎機FW100（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1104型電子分析天平（天津鑫博得儀器有限公司）；紫外分光光度計UV2400（天津精密科學儀器有限公司）。

2方法

2.1溶液的配制

對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品0.0109g，置于50mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，繼續加70%乙醇溶液至刻度，搖勻，制成每1mL含0.218mg的對照品溶液，然后給溶劑貼上標簽備用。

供試品溶液的制備取陜產瞿麥粉末5g，精密稱取，置于100mL具塞錐形瓶中，加入80%的乙醇50mL，精密稱量，超聲提取25min，取出放置至室溫，加80%的乙醇適量，補足失去的質量，抽濾棄去藥渣，取濾液置于25mL的容量瓶中，得到供試品溶液。

2.2測定波長的選擇

取試驗樣品適量，在亞硝酸鈉溶液為1.0mL5%存在的堿性條件下，經溶液硝酸鋁顯色后，以試劑作為空白參比液在420～700nm波長范圍內測定吸光度，在506nm波長處有最大吸收，故測定時選用此波長。

2.3標準曲線的繪制

精密量取蘆丁對照品溶液2、3、4、5、6、7mL，分別置于25mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液lmL，搖勻，放置5min；加人10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；加入4%氫氧化鈉溶液10mL，用80%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15min，以上述試劑作為空白對照，分別在506nm處測定吸光度[5]。以吸光度（A）為縱坐標，以質量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線。

2.4陜產瞿麥中黃酮得率的計算

陜產瞿麥中總黃酮得率（%）=提取的總黃酮質量/瞿麥粉末質量×100%。

2.5陜產瞿麥中黃酮的提取工藝的條件

2.5.1單因素實驗以乙醇的濃度、液料比、提取功率及超聲時間為單因素，考查各因素對陜產瞿麥中總黃酮得率的影響。

2.5.2響應曲面實驗設計根據Box-Behnken軟件提供的數據模型，以陜產瞿麥總黃酮提取率作為響應面值，并選擇乙醇濃度A、液料比B、功率C這3個因素為自變量，采用統計分析軟件Design-Expert8.0.6中的響應面進行分析，從而獲取最佳工藝參數。見表1。

3結果與分析

3.1蘆丁標準曲線

按照2.3的方法繪制蘆丁標準曲線，以蘆丁對照品的質量（mg）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得到蘆丁對照品的標準曲線為Y=0.4637X-0.0426，相關系數R2=0.9966，由此說明蘆丁對照品的質量在0.4～1.6mg范圍時吸光度與質量呈良好的線性關系。

3.2單因素實驗

3.2.1超聲時間對總黃酮提取率的影響固定乙醇體積分數80%，提取溫度40℃，液料比10（倍），功率160W，準確稱取5g瞿麥粉末5份，提取時間分別按10min、15min、20min、25min、30min、35min，進行超聲提取，根據陜產瞿麥中總黃酮的得率確定最佳超聲功率。見圖1。

從圖1可以看出，總黃酮得率隨著超聲時間的增加逐漸上升，到25min時上升較平緩，其原因可能為隨著超聲時間的增長，是黃酮類化合物溶出不明顯，已經達到飽和[6]。因此，雖然提取時間增長了，但總黃酮的得率變化不大。所以，選擇25min為最佳提取時間。

3.2.2乙醇濃度對總黃酮提取率的影響固定液料比10（倍），功率160W，提取溫度40℃，提取時間25min，準確稱取5g瞿麥粉末5份，分別用乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%的乙醇超聲提取，根據陜產瞿麥中總黃酮的得率確定最佳乙醇濃度。見圖2。

從圖2可以看出，總黃酮得率隨著乙醇濃度的增加逐漸上升，開始時黃酮得率增加明顯，但當乙醇濃度達到80%以后黃酮得率開始下降。其原因可能是隨著乙醇濃度的增加，脂溶性的成分被溶解出來，從而干擾了黃酮類化合物的提取，導致總黃酮的得率反而降低[7]。因此，乙醇濃度以80%左右較為合適。

3.2.3料液比對總黃酮提取率的影響固定乙醇體積分數80%，功率160W，提取溫度40℃，提取時間25min，準確稱取5g瞿麥粉末5份，分別按液料比（倍）為8、9、10、11、12，進行超聲提取，根據陜產瞿麥中總黃酮的得率確定最佳液料比。見圖3。

由圖3可以看出，總黃酮的得率隨液料比的增加而逐漸增大，當料液比大于10（倍）時，總黃酮的得率逐漸降低，其原因可能是當液料比增大到一定程度時導致一些非黃酮類物質溶出，與黃酮類物質競爭溶出，干擾了黃酮類物質的溶出[8-9]。因此選取10（倍）為最佳液料比。

3.2.4超聲功率對黃酮提取率的影響固定乙醇體積分數80%，提取溫度40℃，液料比10（倍），功率160W，提取時間25min，準確稱取5g瞿麥粉末5份，分別按80W、100W、120W、140W、160W，進行超聲提取，根據陜產瞿麥中總黃酮的得率確定最佳超聲功率。見圖4。

由圖4可知，總黃酮得率隨著超聲功率的增加逐漸上升，當超聲功率為140W時瞿麥總黃酮的得率最高，140W以后總黃酮得率逐漸下降。理論上講超聲功率越大，細胞壁越容易被破壞，越有利于物質的溶出，但在黃酮類物質溶出的同時也導致黃酮類物質結構的破壞或是其他非黃酮類物質的溶出，干擾了總黃酮的得率[10]。因此超聲功率選用140W最合適。

3.3響應面試驗及結果分析

3.3.1響應曲面法在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert8.0.6軟件，以乙醇濃度A、液料比B、功率C作為超聲輔助提取陜產瞿麥中總黃酮提取率的影響因素，再通過以總黃酮的提取率作為響應平表數據進行帶入分析，得到表2和表3的回歸分析結果。

3.3.2回歸模型方程根據表3.6中，陜產瞿麥中總黃酮的提取率作為響應值，再使用Design-Expert8.0.6對數據進行全面的分析，最終得到了多元二次回歸模型方程：

其中：Y為陜產瞿麥中總黃酮的提取率，A、B、C為3因素的編碼值。

從回歸方程方差分析表中可發現，P模型<0.0001，F模型=76.89>0.05，表明了本研究選用的二次回歸方程模型非常顯著，可以用于實際的預測。陜產瞿麥中總黃酮的提取率F失擬=1.44>0.05，P失擬=0.3564>0.05，表示失擬不顯著。表中的決定系數R2=0.9093，調整確定系數R2Adj=0.9771，說明此模型的實驗值與擬合值之間有很好的擬合度。

綜上所見，該模型可以很好表示出自變量和響應值之間的關系[12-13]。結合表2和表3我們可以分析看出，A、B、AB和BC對陜產瞿麥中總黃酮的提取率都產生顯著的影響，其中A和AB對陜產瞿麥中總黃酮的提取率極顯著。各因素對于陜產瞿麥總黃酮的提取率影響的排序：乙醇濃度A>料液比B>超聲功率C。