逍遙散對慢性應激肝郁脾虛證大鼠行為學及學習記憶能力的影響

連利軍 李曉紅 馮雯倩 李熠毅 蔣筱 肖華業(yè) 楊力強

摘要 目的：觀察慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠行為學與學習記憶能力的變化及逍遙散的調(diào)節(jié)作用。方法：采用慢性束縛應激方法（每天束縛3h，連續(xù)21d）制作大鼠模型并用逍遙散進行干預。將45只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、逍遙散組，15只/組。觀察各組大鼠一般狀態(tài)，測量大鼠體重、攝食量、曠場實驗行為學指標，并用Y迷宮測試各組大鼠學習記憶能力。結(jié)果：1）模型組大鼠在慢性束縛應激初期表現(xiàn)為強烈的反抗、嘶叫，后期表現(xiàn)為神態(tài)倦怠、情志抑郁及不再抵抗的行為絕望狀態(tài)；2）與正常組比較：模型組大鼠體重、攝食量顯著下降（P<0.01）；曠場實驗模型組大鼠5min運動總距離減少（P<0.05），5min平均移動速度減慢（P<0.05），中央?yún)^(qū)停留時間增加（P<0.05）；Y迷宮測試，模型組大鼠正確反應率降低（P<0.01），全天總反應時間增加（P<0.01）；3）逍遙散對模型組大鼠上述改變均有一定的調(diào)節(jié)作用。結(jié)論：逍遙散對肝郁脾虛證大鼠體重、攝食量及行為學的異常變化具有改善作用，并能提高其學習記憶能力，表現(xiàn)出抗抑郁、焦慮作用。

關(guān)鍵詞 逍遙散；慢性束縛應激；肝郁脾虛證；行為學；學習記憶

AbstractObjective：Toobservethechangesofbehaviorandlearningmemoryabilityofchronicimmobilizationstressliver-stagnationandspleen-deficiencysyndromeratsandtheregulatoryeffectofXiaoyaoPowder.Methods：Atotalof45maleSDratswererandomlydividedinto3groups：normalcontrolgroup，modelgroupandXiaoyaopowdergroup.Theratmodelwasestablishedbychronicimmobilizationstress（dailybindingfor3h，for21days）andintervenedwithXiaoyaopowder.Thegeneralstateofratsineachgroupwasobserved，andthebodymass，foodintake，open-fieldexperimentbehavioralindicatorsweremeasured.Y-mazewasusedtotestthelearningandmemoryability.Results：Theratsinthemodelgroupshowedstrongresistanceandscreamingattheearlystageofchronicimmobilizationstress，andlaterappearedasburnout，emotionaldepressionanddesperatestateofbehaviorofnolongerresistance.Comparedwithnormalgroup：thebodymassandfoodintakeofmodelgroupratsdecreasedsignificantly（P<0.01）；Intheopen-fieldexperiment，thetotallengthof5minutesmotiondecreased（P<0.05），andtheaveragemovingspeedof5minutessloweddown（P<0.05），andthestayperiodincenterzoneincreased（P<0.05）；InY-mazetest，theratsinmodelgroupshowedthatthecorrectreactionratedecreased（P<0.01），andthetotalreactiontimeincreasedthroughouttheday（P<0.01）.XiaoyaoPowdercanregulatetheabovechangesinthemodelgrouprats.Conclusion：XiaoyaoPowdercanregulatetheweight，foodintakeandabnormalbehaviorsofliver-qiandspleendeficiencyrats.Itcanalsoimprovethelearningandmemoryabilityandthestateofdepressionoranxiety.

KeyWordsXiaoyaopowder；Chronicimmobilizationstress；Syndromeofliverdepressionandspleendeficiency；Behavior；Learningandmemory

中圖分類號：R289.3；R277.7文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.048

逍遙散最早記載于《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白芍、白術(shù)、茯苓、當歸、甘草、生姜、薄荷8味藥物組成，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效，是治療肝郁脾虛證的經(jīng)典名方，也是抗應激損傷的經(jīng)典方劑之一，對肝郁脾虛證及慢性應激有很好療效[1-2]。課題組前期在全基因組水平上系統(tǒng)探索了逍遙散治療慢性應激肝郁脾虛證大鼠的作用機理[3-4]，本實驗觀察逍遙散對慢性應激肝郁脾虛證大鼠行為學及學習記憶的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物雄性SD大鼠45只，體重180～220g，合格證號：SCXK（桂）2009-0002（廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供）。飼養(yǎng)于普通級動物房，室內(nèi)溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，喂常規(guī)飼料及飲用水。實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

1.1.2藥物逍遙散藥物組成：柴胡30g、當歸30g、白芍30g、白術(shù)30g、茯苓30g、炙甘草15g、生姜10g、薄荷10g（后下）。中藥飲片由廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院提供，用水煎成湯劑，將藥物濃縮至含生藥量1.67g/mL，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3試劑與儀器1）大鼠曠場行為測試箱：長×寬×高為100cm×100cm×40cm的木制箱。底面用黑線劃分成面積相等的25個正方形方格，每行和每列各5個方格，中心9格為中央?yún)^(qū)。曠場箱中央正上方安置攝像頭，觀察記錄大鼠活動情況。2）Y迷宮刺激器：Y迷宮也稱3等分輻射式迷路箱，由等長的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂（每臂長45cm）和3者的交界區(qū)組成。箱底鋪設(shè)直徑0.2cm、長14cm、間距1cm的電柵，臂的內(nèi)壁均貼有與相應電柵相通可導電的薄層銅片，每條臂頂端裝有一盞15W的刺激信號燈。控制面板有電壓控制按鈕、延時控制按鈕和0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ4個按鍵，當按下0鍵時，3臂均不通電，交界區(qū)通電，當分別按下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ鍵時，相應臂的信號燈亮，此時該臂不通電為安全區(qū)，另外無燈光的兩臂及交界區(qū)均通電而成為非安全區(qū)（電擊區(qū)）[5]。Y迷宮3條臂交界區(qū)的正上方安置攝像頭。3）行為學記錄分析軟件：美國StoeltingAnymaze視頻分析系統(tǒng)（60000）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備45只雄性SD大鼠按體重隨機分為3組，每組15只，分別為正常組、模型組、逍遙散組。采用束縛方法制作肝郁脾虛證大鼠模型，正常組大鼠不予束縛，自由進食、飲水及自主活動，模型組和逍遙散組大鼠均束縛于特制的大鼠束縛架上，束縛時間點隨機，每日3h，連續(xù)21d。

1.2.2干預方法每天在束縛前1h給逍遙散組大鼠灌服1mL/100g逍遙散中藥煎液，正常組和模型組大鼠灌服1mL/100g生理鹽水，造模期間根據(jù)大鼠體重調(diào)整給藥量。

1.2.3檢測指標與方法1）一般狀態(tài)觀察：每天觀察大鼠對束縛的反應、精神狀態(tài)、活動情況、身體姿勢、毛發(fā)、爪甲和耳廓的色澤以及糞便的變化等全身和局部情況。2）體重：實驗開始前1d稱量大鼠體重，作為第0天體重。實驗開始后每天上午7：00稱量大鼠體重，計算第1周、第2周、第3周各組大鼠體重增長量并進行比較。3）攝食量：實驗開始后每籠大鼠給一定量飼料，第2天上午7：00稱量每籠大鼠所剩飼料量，計算第1周、第2周、第3周各組大鼠每天平均進食量并進行比較。4）曠場實驗：21d造模結(jié)束后，各組大鼠于第22天進行曠場實驗，利用同步錄像、計時，觀察5min大鼠在曠場行為測試箱內(nèi)的活動情況。測量指標包括運動總距離、平均移動速度、中央?yún)^(qū)停留時間。5）Y-迷宮實驗：Y-迷宮測試方法參照文獻方法[5-6]，實驗開始時，將大鼠放入迷宮中適應3～5min，然后按改良的“不固定次數(shù)隨機不休息法”[7]轉(zhuǎn)換按鍵開關(guān)以變換安全區(qū)與電擊區(qū)的位置，觀察大鼠學會逃離電擊區(qū)而進入安全區(qū)的反應能力。a.不固定次數(shù)：安全區(qū)以無規(guī)則次序變換，但實驗在同一天內(nèi)完成，采取分段連續(xù)法，即每測試10次，休息1min，以連續(xù)10次中有9次或以上正確反應為達到學會標準，如果動物迅速達標，則停止實驗，最大測試次數(shù)為30次。b.隨機：指隨意更換安全區(qū)方位。c.不休息：兩次測試之間不熄燈，也不給大鼠休息時間。d.正誤判定的標準：以大鼠在足底通電后10s內(nèi)1次性跑向安全區(qū)為正確反應，否則為錯誤反應。觀察指標如下：a.正確反應率（%）：正確反應數(shù)占總測試數(shù)的百分比；b.主動回避率（%）：大鼠在燈亮后但未通電的5s內(nèi)完成逃避反應的次數(shù)占總反應次數(shù)的百分率。c.全天總反應時間（TotalReactionTime，TRT）：即一個實驗日（全天）完成所有訓練（包括正確反應和錯誤反應）所需時間。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS21統(tǒng)計軟件，用單因素方差分析及t檢驗進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1逍遙散對模型組大鼠一般狀態(tài)的影響造模前，各組大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、糞便以及自主活動等方面均無明顯差異。造模第1天初次束縛大鼠時，大鼠表現(xiàn)出強烈的反抗、嘶叫、拼命撕咬束縛架，尾巴掙扎很厲害，大便小便明顯增多。造模7d后，模型組大鼠束縛時反抗降低，嘶叫和掙脫束縛減少，靈敏度降低，耳廓與爪部顏色逐漸變淡，皮毛逐漸泛

黃。造模第14天到第21天，模型組大鼠逐步出現(xiàn)神態(tài)倦怠、反應遲緩、扎堆或蟄伏在角落、耳廓與爪部顏色變淺淡、光澤減少、皮毛泛黃干枯極易掉落、大便多稀溏，束縛捉拿時身體較軟，反抗減少，甚至停止掙扎。逍遙散組大鼠初期表現(xiàn)與模型組大鼠無明顯差別，從第2周開始各種表現(xiàn)較模型組好轉(zhuǎn)，到第3周末，精神狀態(tài)良好，動作靈活，耳廓與爪部顏色淡粉，毛發(fā)整潔，光澤較好，麥粒形糞便。正常對照組大鼠一般狀態(tài)沒有明顯改變。

2.2逍遙散對模型組大鼠體重的影響與正常對照組比較，模型組與逍遙散組大鼠在造模第1周和第2周體重增長緩慢（P<0.01）；造模第3周，模型組大鼠體重增長較正常對照組、逍遙散組明顯減少（P<0.01），逍遙散組大鼠體重增長幅度比正常小，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3逍遙散對模型組大鼠攝食量的影響與正常對照組比較，模型組與逍遙散組大鼠在造模第1周和第2周進食量均減少（P<0.01或P<0.05）；造模第3周，模型組大鼠攝食量較正常對照組、逍遙散組明顯減少（P<0.01），逍遙散組大鼠進食量增加，與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.4逍遙散對模型組大鼠曠場實驗的影響見表3。造模21d后，模型組大鼠與正常組、逍遙散組比較，5min運動總距離減少（P<0.05），5min平均移動速度減慢（P<0.05），中央?yún)^(qū)停留時間增加（P<0.05），提示逍遙散能改善模型大鼠曠場實驗行為學各項指標的變化，逍遙散組大鼠各項指標與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.5逍遙散對Y迷宮實驗的影響見表4。造模21d后，模型組大鼠正確反應率低于正常組（P<0.01），全天總反應時間高于正常組（P<0.01），逍遙散能顯著提高模型大鼠正確反應率、減少全天總反應時間（P<0.05），各組大鼠主動回避率組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3討論

應激是指機體受到各種應激原刺激時，出現(xiàn)以交感興奮和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（HPA）軸分泌增多為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應，以及由此引起機體各種功能和代謝的改變。適宜的應激反應能夠提高個體對壞境的適應和生存能力，而過度的尤其是慢性應激反應導致機體出現(xiàn)不同程度的生理、心理障礙，嚴重影響人類的生活健康。如慢性應激可以導致抑郁、焦慮已成為公認的事實，諸多的實驗研究報道在曠場實驗、Y迷宮實驗、高架十字迷宮實驗等行為學測試中慢性應激大鼠表現(xiàn)出學習記憶能力下降和行為學的異常變化，而逍遙散作為抗應激損傷的經(jīng)典名方，可改善應激大鼠抑郁、焦慮癥狀、行為學的異常改變及學習記憶功能的減退[8-11]。

慢性束縛大鼠模型被廣泛應用于應激模型的研究，束縛應激作為一種非損傷性刺激剝奪了動物的活動自由，與人類身心性疾病的致病過程有形似性，慢性束縛應激方法所造成的慢性心理應激反應，其主要病位在肝[12]。肝主疏泄，性喜條達而惡抑郁。從中醫(yī)理論分析，若本能需求適度并得以滿足，為肝主疏泄正常，條達舒暢。實驗中，初次束縛大鼠時，大鼠表現(xiàn)出強烈的反抗、嘶叫、拼命撕咬束縛架、掙扎欲脫等行為，這是由于大鼠的本能活動突然受到遏制，情志受到強烈的刺激，肝疏泄太過出現(xiàn)的癥狀表現(xiàn)。隨著束縛時間延長，大鼠逐漸表現(xiàn)出情志抑郁，活動減少，束縛時反抗減少，甚至停止掙扎等表現(xiàn)，這是由于大鼠的本能需求長期受到遏制，肝疏泄不及而為氣郁，這些癥狀表現(xiàn)符合中醫(yī)的肝氣郁結(jié)證。肝郁日久，肝氣橫逆犯脾，損傷脾胃之氣，導致脾失健運。“脾胃為后天之本，氣血生化之源”，脾失健運，攝食減少，氣血生化不足，導致模型大鼠出現(xiàn)體重增長緩慢，毛發(fā)干枯發(fā)黃，四肢和耳廓顏色變淺。從慢性束縛應激大鼠在21d束縛過程中，由最初的易怒、抗爭逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榻箲]、抑郁、乏力、食欲減少、體重增長緩慢、便溏等癥狀表現(xiàn)來看，符合中醫(yī)肝郁致脾虛的發(fā)展過程。給予中藥復方逍遙散干預后，逍遙散組大鼠一般狀況明顯好轉(zhuǎn)，逍遙散能夠有效緩解慢性束縛應激所產(chǎn)生的對攝食量和機體生長的影響。

曠場實驗（OFT）是目前最常用的一種檢測動物心理的經(jīng)典行為學監(jiān)測方法，能夠用量化的指標客觀反映動物類似人的復雜情緒如抑郁、焦慮程度及對未知的探究欲望等。OFT反映動物心理行為的觀察指標有直立、攀壁、修飾等垂直運動參數(shù)和走動的距離、速度、進入中央?yún)^(qū)次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留時間等水平運動參數(shù)。本實驗選取大鼠在中央?yún)^(qū)停留時間和5min運動的總距離及平均速度作為觀察指標。中央?yún)^(qū)停留時間表示動物啟動活動的潛伏期，反映動物的空間認知能力和對新環(huán)境的好奇程度[13]，如果空間認知能力差，對新環(huán)境淡漠，處于焦慮或抑郁狀態(tài)，則動物進入開闊的中央?yún)^(qū)域時向四周移動產(chǎn)生遲疑，在中央?yún)^(qū)的停留時間就會延長[14]。運動總長度和運動平均速度主要反映動物的運動情況，當動物處于精神抑郁狀態(tài)時運動能力和自主活動的欲望會隨之下降。本次實驗結(jié)果顯示模型組大鼠中央?yún)^(qū)停留時間顯著高于正常組、逍遙散組，5min運動的總距離及平均速度顯著低于正常組和逍遙散組，而逍遙散組大鼠接近于正常組大鼠水平，兩者比較，差異無統(tǒng)計學意義。說明21d束縛應激造成了大鼠身心疲勞、情志抑郁、自主活動能力以及對新環(huán)境的探究能力、空間認知能力下降，而逍遙散能夠有效緩解大鼠的應激狀態(tài)。再結(jié)合課題組前期的研究結(jié)果模型組大鼠出現(xiàn)HPA軸紊亂[15]，CRHR2在海馬組織的表達降低[16]，支持模型組大鼠出現(xiàn)焦慮抑郁的癥狀表現(xiàn)，該大鼠模型為肝郁脾虛證抑郁模型。

Y迷宮實驗是評估動物學習記憶能力的常用方法之一，Y迷宮可同時檢測動物對空間位置覺和方向覺的辨別能力和逃避條件反射能力。本次Y迷宮實驗結(jié)果顯示模型組大鼠正確反應率顯著低于正常組和逍遙散組、全天總反應時間顯著高于正常組和逍遙散組，而逍遙散組大鼠正確反應率、全天總反應時間接近于正常組，表明21d慢性束縛應激損害了大鼠的學習和記憶功能，而逍遙散能夠明顯改善大鼠的抑郁狀態(tài)，提高其學習記憶功能。以往也有眾多實驗結(jié)果表明慢性應激大鼠Y迷宮測試成績明顯下降[17-18]。

中醫(yī)學認為“有諸內(nèi)者，必形之于外”，機體外部的表現(xiàn)在一定程度上反映了機體內(nèi)部的情況。行為是機體功能的外在表現(xiàn)，學習記憶是腦的重要功能之一，神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)是行為和學習記憶的生理學基礎(chǔ)。以往的研究認為慢性應激可以使腦內(nèi)邊緣系統(tǒng)、額葉皮層、尤其是海馬的神經(jīng)細胞可塑性下降、凋亡與再生平衡失調(diào)，從而引起認知、情感、行為和學習記憶能力等改變[19]。我們前期的慢性應激大鼠海馬基因表達研究也顯示模型組大鼠海馬神經(jīng)細胞生長抑制，凋亡加速，眾多與抑郁、焦慮、學習記憶相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)、激素出現(xiàn)了變化[16]，表明模型組大鼠出現(xiàn)行為學異常、學習記憶能力下降是有其內(nèi)在的生物學基礎(chǔ)發(fā)生了變化的。盡管課題組前期對肝郁脾虛證的生物學機制及逍遙散的作用機理進行了大量的研究，之前的研究結(jié)果也能夠解釋肝郁脾虛證大鼠出現(xiàn)食欲減少、體重減輕、情志改變、行為學異常及學習記憶能力的下降等癥狀表現(xiàn)，也部分揭示了逍遙散治療肝郁脾虛證及慢性應激的作用機理，但中醫(yī)的證是一個復雜的系統(tǒng)，中藥復方具有多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)的作用特點。因此，要明確慢性應激肝郁脾虛證大鼠更多與行為學相關(guān)的生物學機制及逍遙散的作用機理，有待今后更深入的研究。

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（2018-04-19收稿責任編輯：徐穎）