激光誘導(dǎo)胃體組織自體熒光診斷早癌的檢測系統(tǒng)研究及臨床實驗

陳正義，歐輝彬，傅昇，林松挺，鐘文州

1. 海口市人民醫(yī)院，海南 海口 570208；2. 竹腳婦幼醫(yī)院 兒科醫(yī)學(xué)學(xué)部，新加坡 299899，新加坡

引言

對癌癥的診斷臨床目前主要用取樣活檢，通過病理學(xué)這個“金標準”給于確診，活檢是指對組織標本進行病理組織切片檢查，有較高的準確率，但缺點是微小病變和較深層病變很容易漏檢，為此人們一直在尋找一種能替代活檢方法，自體熒光診斷技術(shù)就是在這樣背景下產(chǎn)生，從而引發(fā)了人們對它的探索和研究[1]。激光誘導(dǎo)自體熒光（Laser-Induced Auto fl uorescence，LIAF）診斷技術(shù)是采用一定波長的激光作為激發(fā)光源，激發(fā)組織產(chǎn)生自體熒光[2]，其利用正常組織與癌變組織自體熒光光譜及強度存在明顯差異來診斷病變，具有靈敏度高、實時、無損、準確、診斷需時短等特點，使臨床診斷早癌普查變?yōu)楝F(xiàn)實[3]。本文以海南省2017年度重點研發(fā)計劃項目“激光誘導(dǎo)自體熒光技術(shù)研究及其診斷消化道早癌的臨床應(yīng)用”為背景，應(yīng)用LIAF診斷技術(shù)在臨床上做了在體實驗對其理論基礎(chǔ)和應(yīng)用進行了深入的研究與探討。

1 激光誘導(dǎo)自體熒光的原理及檢測系統(tǒng)組成

1.1 激光誘導(dǎo)自體熒光的原理

一束激光照射人體組織后，生物分子吸收了光能，該分子會從基能態(tài)躍升到高能態(tài)，處于高能態(tài)的分子極不穩(wěn)定，在一定時間內(nèi)它從高能態(tài)返回基能態(tài)，以光能形式向外釋放之前吸收的外來能量，在此過程中分子會通過自行釋放能量而產(chǎn)生熒光，此過程是通過激光誘導(dǎo)而產(chǎn)生自體熒光[4]；早期癌是指病變浸潤不超過粘膜下層的癌，其中局限于黏膜層的稱為“黏膜內(nèi)癌”，其特點是癌變病灶小，厚度薄，癥狀不明顯，尤其平坦型或黏膜下病變，更不易發(fā)覺，僅憑肉眼和常規(guī)的檢測手段很難發(fā)現(xiàn)，極易漏診[5]。消化道早癌檢測系統(tǒng)就是基于人體生物分子的熒光特性來研究的，自體熒光的光譜特征與生物組織的光學(xué)特性有關(guān)[6]。由于人體不同組織的生化組成和形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，因而不同組織具有獨特的光學(xué)特性和光譜特征，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人體組織有許多較重要的熒光物質(zhì)，如膠原蛋白（熒光峰400 nm）、黃素腺嘌呤二核苷酸（熒光峰520 nm）、彈性蛋白（熒光峰400 nm）、血卟淋衍生物（熒光峰630 nm和680 nm），正常組織和腫瘤組織由于分化不同，會有不同的生化成分，或者生化成分相似，但各成分比例卻不同[7]；因此，正常組織和腫瘤組織在受到同樣條件下激光照射時所產(chǎn)生的自體熒光光譜形狀和強度即波長曲線不同，因而可根椐熒光光譜形狀的差異性來區(qū)分他們，相關(guān)研究表明腸癌組織，胃癌組織都具有這種特性，使用熒光光譜分析的方法能將他們與正常組織區(qū)別開來[8]。

1.2 檢測系統(tǒng)組成

檢測系統(tǒng)主要由特制光纖、激光器、光譜儀、光譜分析軟件、計算機等組成，該系統(tǒng)采用超低功率的半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的激光作為激光光源，光纖傳導(dǎo)激光及收集被激發(fā)的自體熒光，自體熒光由微型光譜儀負責(zé)接收處理。激光波長405 nm，輸出功率為5 mW，光纖在內(nèi)窺鏡（活檢通道）的輔助下進入人體腸道或胃內(nèi)從而實現(xiàn)對腫瘤組織的在體實時檢測，熒光通過光纖傳輸?shù)焦庾V儀，由它對光信號進行采集處理并送入計算機由專業(yè)應(yīng)用軟件對熒光譜進行分析處理并通過顯示器顯示組織熒光光譜曲線圖，供臨床研究分析診斷[9]。檢測系統(tǒng)連接圖，見圖1。

圖1 檢測系統(tǒng)連接圖

光譜儀采用美國海洋光學(xué)QE Pro高性能光譜儀，具有的高靈敏度與寬動態(tài)范圍的特性使其成為了同等級中性能最高的微型光譜儀；其波長范圍可在185～1100 nm范圍內(nèi)配置，系統(tǒng)信噪比為1000:1，配備了18位A/D轉(zhuǎn)換器，其容納15000張光譜圖的緩沖區(qū)可以在高速采集中保證數(shù)據(jù)的完整性，同時其先進的光學(xué)設(shè)計與熱電致冷器件可以大大提高長時間檢測的熱穩(wěn)定性；QE Pro因而具有超高的動態(tài)范圍，成為當前市場上靈敏度最高的微型光譜儀。激光光源采用波長為405 nm，輸出功率5 mW，低功率、高精度、高穩(wěn)定性的藍激光器[10]。光纖探頭由定制的七根光導(dǎo)纖維組成，中間一根為發(fā)射光纖，激光束通過它照射到待測組織，周圍六根為接收光纖，作用是收集熒光并將光信號輸入光譜儀進行處理[11]。光纖探頭一方面將激光傳送到待檢組織表面，另一方面收集弱熒光信號并耦合至光譜儀，為了能伴隨內(nèi)窺鏡檢查時做彎曲動作，光纖探頭前端做的較短以便光纖前端能隨內(nèi)窺鏡頭部彎曲而彎曲，同時光纖材料必須具有很好的撓度，利用石英光纖透過率高適應(yīng)長距離傳輸且光信號衰減小等特征[12]；針對胃體組織檢測的要求，我們專門定制了一根2.8 m長傳輸丫型光纖；光纖的一頭通過內(nèi)窺鏡活檢口接觸待檢組織，另一頭的分叉一端連接激光光源，另一端連接光譜儀。

我們在硬件平臺搭建時對部件進行優(yōu)化組合，其特點是在激光器金屬外殼上增加導(dǎo)熱材料和風(fēng)扇散熱，解決激光器運行時產(chǎn)生的熱量及時散發(fā)，同時在集成封裝的外殼上增加空氣對流口；內(nèi)置專用主板主要是通過軟件達到對激光器和光譜儀等設(shè)備的控制，使用獨立電源同時供電驅(qū)動激光器、控制主板、光譜儀。集成內(nèi)部采用短光纖在不影響信號收集時，節(jié)約了大量設(shè)備內(nèi)部空間使得集成外觀更簡潔。

操作軟件采用SpecSuite光譜分析軟件可連接美國海洋光學(xué)全系列光譜儀，獲取光譜測試數(shù)椐，它是一個完全模塊化的光譜軟件平臺，運行在Win2000，XP，Vista，Win7（32位）操作系統(tǒng)，具有采集、調(diào)度、多樣圖譜數(shù)據(jù)處理等功能，每個功能都是一個獨立的模塊，可以添加或刪除模塊為建立一個專有的用戶界面或功能，能在創(chuàng)建的模塊上進行計算、自動化實驗程序等[13]。

2 臨床實驗結(jié)果

對激光誘導(dǎo)自體熒光檢測系統(tǒng)進行調(diào)試，包括波長校準和響應(yīng)特性校準，我們把系統(tǒng)應(yīng)用于胄組織在體自體熒光光譜的檢測和分析，由于研究表明在體標本與離體處理過標本的自體熒光光譜存在較大的差異[14]；因此本實驗全部為電子胃鏡檢查時進行在體胃組織自體熒光光譜的檢測，同時對病變組織標本取樣，所有診斷以病理診斷結(jié)果為準，在相同條件下（QE Pro光譜儀使用參數(shù)為積分時間為50 ms，平均次數(shù)為10次，平滑寬度為5，波段：480～750 nm）對海口市人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心41個患者進行連續(xù)LIAF光譜檢測和分析，其中男性26例，女性15例，年齡26～82歲依據(jù)病理診斷結(jié)果共測試了6個糜爛性胃炎，11個活動性胃炎，3個表淺性胃炎，6個萎縮性胃炎，3個胃潰瘍，7個增生性息肉，3個鱗狀細胞癌，2個管狀腺瘤和41個正常組織；并從以上病例中選出典型的自體熒光光譜曲線圖，見圖2，以磷狀細胞癌光譜圖為中心分別與正常胃體組織，炎性組織、增生組織等進行橫向分析比較查找出其差異性。

圖2 典型的自體熒光光譜曲線圖

分析圖2a～f以及測量獲的所有自體熒光光譜，發(fā)現(xiàn)胃體正常組織與胃炎、增生及癌變組織的自體熒光光譜發(fā)現(xiàn)有以下一些特征，不論是正常組織還是炎癥組織、腺瘤組織、增生組織和癌變組織主峰都為700 nm，有兩個左右次峰分別為670 nm和720 nm，主峰的寬度（約30 nm）明顯比次峰的寬度（約10 nm）大；胃體正常組織的光譜強度計數(shù)單位在1200～1800之間，同一病人正常組織的光譜主峰強度計數(shù)（為1800）高出鱗狀細胞癌組織對應(yīng)位置光譜強度（計數(shù)單位為950）近二倍，左右側(cè)次峰分別比正常組織對應(yīng)位置低400～1000計數(shù)單位，熒光強度減弱的原因可能是腫瘤組織粘膜層厚度增加導(dǎo)致的[15]，整個光譜呈剪刀狀；在波長為500 nm時，光譜圖上下曲線強度差最大為8500個計數(shù)單位比炎癥、增生、腺瘤等組織有明顯差別（光譜圖上下最大強差：糜爛胃炎組織為1200個計數(shù)單位，慢性活動性胃炎組織為3000個計數(shù)單位，慢性潰瘍組織為3000個計數(shù)單位，管腺瘤組織為3300個計數(shù)單位），從圖2a～f中鱗狀細胞癌組織光譜曲線上能看到480、550、580 nm左右有坡谷形成，而正常組織、炎癥組織、腺瘤組織、增生組織的光譜圖550、610 nm左右有波谷形成，位置也比較固定，研究表明這些波谷認為是由于血紅蛋白在這些波長位置的強吸收作用而造成的，它的吸收效應(yīng)對癌變組織的作用更大[16]；從圖2a～f中可見癌變組織光譜圖曲線從波長580 nm到左次峰670 nm之間呈上升趨勢，而正常組織正好相反出現(xiàn)下降趨勢，炎癥、潰瘍、增生、腺瘤等組織與正常組織的光譜圖曲線在該波段卻呈現(xiàn)出相同下降趨勢。

3 討論

從臨床實驗表明，LIAF光譜檢測技術(shù)可以明確區(qū)分正常組織與癌變組織，使早期診斷癌癥變?yōu)榭赡埽哂邪l(fā)展的應(yīng)用前景；從光譜圖可見胃炎癥組織在強度上比正常組織低，而息肉組織強度卻比正常組織高，正常組織比癌變組織光譜強度高了近二倍，癌組織產(chǎn)生較弱的熒光與激發(fā)光難于穿透癌組織激發(fā)到黏膜下層的熒光物質(zhì)有關(guān)[17]；由于癌變組織的血流豐富，血紅蛋白對紫外光的吸收，造成綠—黃熒光的減弱和紅色熒光的相對增強[18]；或許與胃組織癌變后膠原含量不同導(dǎo)致熒光減少有關(guān)，還需在今后的研究中以證實。

致謝

感謝海南省科學(xué)技術(shù)廳將“激光誘導(dǎo)自體熒光技術(shù)研究及其診斷消化道早癌的臨床應(yīng)用”為2017年海南省重點研發(fā)計劃立項，并提供經(jīng)費支持，同時感謝消化內(nèi)鏡中心醫(yī)護人員對這一科研項目的支持與合作。沒有大家的共同努力，我們無法完成這一課題，也無法取得這樣的成績。