苜蓿中華根瘤菌烯酯酰ACP還原酶FABI2的原核表達純化以及多克隆抗體的制備

張亞璇，王海洪，樊振川

(1.天津科技大學大健康生物技術研究所，天津市大健康生物技術國際聯合研究中心，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.華南農業大學生命科學學院，廣州 510642)

脂肪酸合成代謝是生物細胞中的基礎代謝之一，是細胞膜形成的第一步，對細菌生理有關鍵作用．根據合成酶系統的差異，脂肪酸生物合成系統的酶被分為Ⅰ型脂肪酸合成酶系(FASⅠ)和Ⅱ型脂肪酸合成酶系(FASⅡ)[1-2]．烯酯酰ACP還原酶是Ⅱ型脂肪酸合成途徑中的關鍵酶之一，它催化延伸反應的最后一步，將反-2-烯酰 ACP還原為飽和酯酰 ACP[3]．最早被鑒定的烯酯酰 ACP還原酶基因是大腸桿菌(Escherichia coli)中的fabI，隨著基因組測序的完成，基因組信息揭示了苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)基因組中有這一基因的同源基因 fabI1和fabI2．這兩個基因都位于環狀的染色體上，fabI1由smc00005編碼，fabI2由 smc00326編碼[4-5]，與脂肪酸合成基因fabBA相鄰．它們與大腸桿菌FABI蛋白的相似度為51%,和50%,，且fabI2的序列與fabI1有66%,的一致性[6]，但兩個基因及相應酶存在差異．

苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)[7-8]是一類能與豆科苜蓿類植物共生形成根瘤的革蘭氏陰性細菌．目前對其研究主要集中在共生固氮機制和抗逆性兩個方面[9]，并證明了脂肪酸合成系統對苜蓿中華根瘤菌的共生固氮和抗逆性均有顯著影響，但對于基因 fabI2功能研究還未深入．本實驗制備苜蓿中華根瘤菌烯酯酰 ACP還原酶基因 fabI2的抗體，是順利完成FABI2在蛋白水平表達模式以及FABI2與其他蛋白互作機制研究的重要前提，有利于進一步對fabI2基因在脂肪酸合成中的功能進行深入研究．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-blue、BL21(DE3)感受態細胞為本實驗室保存．pET-28b-FABI2質粒為華南農業大學王海洪教授提供．

1.1.2 試劑

實驗所用的酶及相對應的緩沖液、DNA相對分子質量marker和蛋白marker，美國Thermo公司；Ni SepharoseTM6,Fast Flow、Glutathione SepharoseTM4B蛋白純化填料和 Protein A SepharoseTMCL-4B抗體純化填料，美國 GE Healthcare 公司；弗式完全佐劑和不完全佐劑，美國Sigma公司；HRP標記的羊抗兔抗體，美國Cell Signaling公司；其他試劑均為國產分析純．

1.1.3 試驗動物

新西蘭大白兔 2只，普通級，體質量 1.5～2.0,kg，由北京市海淀區興隆實驗動物養殖場提供，許可證號為SCXK(京)2016-0003．

1.2 方法

1.2.1 pGEX-2T-FABI2原核表達載體的構建

設計帶有 BamHⅠ和 HindⅢ酶切位點的引物從pET-28b-FABI2質粒中擴增目的片段，引物設計為上游引物加入 BamHⅠ酶切位：5′-ATGGATCCATG AACGGATTGATGAAC-3′，下游引物加入 HindⅢ酶切位點：5′-ATAAGCTTTTAATCCGCGTCTGCGAC-3′．反應條件：95,℃ 2,min；95,℃ 30,s；56,℃ 30,s，30個循環；72,℃ 1,min；72,℃終延伸 15,min．利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收擴增產物后，再用 BamHⅠ和HindⅢ分別將回收的目的基因片段、pGEX-2T載體進行酶切；然后用 T4,DNA連接酶連接后，轉入E．coli XL1-blue感受態細胞，經 PCR、雙酶切驗證后，篩選出符合要求的陽性克隆，并進行測序鑒定．

1.2.2 融合蛋白的誘導表達及鑒定

采用化學轉化的方法將 pET-28b-FABI2和pGEX-2T-FABI2轉入大腸桿菌 BL21(DE3)，分別挑取單菌落至5,mL LB液體培養基(分別含100,μg/mL卡那霉素和 120,μg/mL氨芐青霉素)，37,℃搖床過夜培養．再以1∶50的比例放大培養至A600為0.6～0.8時，加入0.1,mmol/L IPTG于20,℃、185,r/min條件下誘導 6,h使蛋白大量表達．4,℃、6,000,r/min離心5,min后收集菌體，用PBS溶液漂洗兩次后用細胞破碎儀超聲裂解 30,min．分別取誘導前、全蛋白、上清液和沉淀與 2×蛋白質上樣緩沖液混合后進行 13%,SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達[10-11]．

1.2.3 融合蛋白的純化

6×His-FABI2融合蛋白誘導表達后，將收集的菌體于裂解液(20,mmol/L NaH2PO4、200,mmol/L NaCl、20,mmol/L 咪唑)中超聲破碎，4,℃、12,000,r/min離心 15,min．取上清液用 0.45,μm 濾膜過濾后加入到預先用裂解液平衡好的Ni SepharoseTM6,Fast Flow純化柱中，室溫結合 1,h后，分別用含有50,mmol/L、100,mmol/L咪唑的裂解液進行漂洗，除去結合不牢的蛋白．最后用含有 500,mmol/L咪唑的裂解液進行洗脫，得到純化后的目的蛋白．將上述收集的流出液組分、漂洗液組分以及洗脫液組分分別用13%, SDS-PAGE檢測蛋白純度[12]．

pGEX-2T-FABI2融合蛋白誘導表達后進行超聲破碎，4,℃、12,000,r/min離心 15,min．取上清液過膜后加入到預先平衡好的 Glutathione SepharoseTM4B純化柱中，室溫結合1,h后，用10倍柱體積的裂解液(1×PBS)進行漂洗，除去結合不牢的蛋白．最后用含有 20,mmol/L還原型谷胱甘肽的裂解液洗脫目的蛋白，得到純化后的目的蛋白．將上述收集的流出液組分、漂洗液及洗脫液組分分別用13%, SDS-PAGE檢測蛋白純度．

1.2.4 免疫

將純化后的 6×His-FABI2融合蛋白稀釋到1,mg/L，取 2,mL蛋白與等體積的弗氏佐劑混合后乳化完全，免疫新西蘭大白兔．采用頸背部多點注射法，初次免疫使用弗氏完全佐劑且免疫前進行耳緣靜脈采血[13]作為陰性對照血清．之后每 10,d進行加強免疫，使用弗氏不完全佐劑，一共加強免疫 3次．最后 1次加強免疫后進行耳緣靜脈采血，利用間接ELISA法測定抗血清的效價．效價合格后，股動脈采血，4,℃靜置過夜后收集血清，分裝凍存．

1.2.5 多克隆抗體效價的檢測

采用 ELISA法檢測抗血清的效價，以 GSTFABI2蛋白作為包被抗原，4,℃包被過夜，用 PBST洗3次以去掉結合不牢的蛋白．用5%,的脫脂乳粉封閉 1,h后，以所得的抗血清為一抗，一抗的稀釋倍數分別為 1∶1,000、1∶2,000、1∶4,000、1∶8,000、1∶16,000、1∶320,000、1∶640,000、128,000，HRP 標記的羊抗兔抗體為二抗，稀釋倍數為 1∶20,000，最后經過TMB顯色，測定450,nm處的吸光度，并計算出抗血清的效價．以實驗組血清 A450與陰性對照血清A450的比值大于2即為陽性，其最高稀釋度即為抗血清的效價．

1.2.6 多克隆抗體的Protein A親合純化

由于 Protein A專一性吸附 IgG，可以去除 IgG之外的其他抗體分子，所以采用 Protein A對抗血清進行親合純化．取 1,mL抗血清加入 13,mL 結合液(20,mmol/L Na2HPO4，pH 7.0)平衡血清．將平衡后的血清經 0.45,μm 濾膜過濾后加入預先平衡好的純化柱中，室溫下與填料結合 30,min．結合完畢后放出流出液，用 0.1,mol/L 甘氨酸洗脫后得到純化后的抗體，經 1,mol/L Tris-HCI(pH 9.0)調節洗脫液至中性后于-80,℃保存．

1.2.7 免疫印跡法檢測多克隆抗體的特異性

對 4次免疫后經 Protein A 純化后的抗體進行免疫印跡檢測多克隆抗體的特異性．樣品為誘導表達的另一標簽抗原 GST-FABI2，將誘導表達后的細胞超聲破碎后離心取上清液，進行13%, SDS-PAGE，轉膜后，用5%,脫脂乳粉封閉1,h．將純化后的多克隆抗體按一定的比例稀釋，稀釋度分別為 1∶300、1∶600、1∶1,000、1：1,200、1∶2,400、1∶4,800，室溫搖床孵育1,h，PBST洗3次．將AP標記的羊抗兔抗體稀釋 10,000倍后，室溫搖床孵育 1,h，最后進行 AP顯色．

1.3 數據統計分析

用 Excel 2010軟件分析數據，計算標準偏差并制圖．

2 結果與分析

2.1 pGEX-2T-FABI2原核表達載體的構建

為了獲得 5′-末端攜帶 GST標簽的 FABI2融合蛋白，構建了 pGEX-2T-FABI2表達載體．以提取的pGEX-2T-FABI2質粒為模板，用之前設計好的FABI2引物進行 PCR驗證和雙酶切驗證，獲得條帶大小約為 807,bp的片段．最后經測序驗證序列完全正確，沒有突變位點，表明表達載體構建成功(圖1).

圖1 fabI2的PCR驗證和重組載體的雙酶切驗證Fig. 1 PCR amplification of fabI2 and restriction identification of recombinant expression plasmids

2.2 6×His-FABI2和 GST-FABI2融合蛋白的誘導表達

SDS-PAGE檢測重組表達載體 pET-28b-FABI2和pGEX-2T-FABI2在E．coli BL21(DE3)中的表達，結果如圖2所示．由圖2可知，在0.1,mmol/L IPTG、20,℃、185,r/min條件下誘導 6,h后，含有 pET-28b-FABI2和 pGEX-2T-FABI2質粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌株分別在約 2.8×104和 5.4×104處大量表達目的蛋白，且蛋白的表達主要集中在上清液．

圖2 SDS-PAGE檢測重組表達載體 pET-28b-FABI2 和pGEX-2T-FABI2在E. coli BL21(DE3)中的表達Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant vectors pET-28b-FABI2 and pGEX-2TFABI2 in E. coli BL21(DE3)

2.3 6×His-FABI2和GST-FABI2融合蛋白的純化

選用 6×His-FABI2融合蛋白作為免疫用抗原.將 6×His-FABI2融合蛋白破碎離心后取上清液，加入含有Ni SepharoseTM6,Fast Flow填料的重力柱中室溫結合1,h或者4,℃過夜．由于融合蛋白的His標簽特異性與上述填料結合，最后經過洗滌、洗脫等步驟可得到純度較高的目的蛋白，純度達 95%,以上(圖3(a))，作為免疫動物所用抗原．

GST-FABI2融合蛋白用于效價的測定和免疫印跡．將破碎后的 GST-FABI2 融合蛋白離心后取上清液，加入含有Glutathione SepharoseTM4B填料的純化柱中進行親和純化，經20,mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫后得到目的蛋白(圖3(b))．

圖3 pET-28b-FABI2重組蛋白和 pGEX-2T-FABI2重組蛋白的SDS-PAGE檢測Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant proteins pET-28b-FABI2 and pGEX-2T-FABI2

2.4 抗血清效價的檢測

用純化得到的6×His-FABI2蛋白免疫新西蘭大白兔，4次免疫后從耳緣靜脈處取少量血，室溫靜置2,h或4,℃過夜后獲得析出血清，通過ELISA法測定抗血清的效價，利用酶標儀測定A450后計算抗血清的效價，結果如圖4所示．由圖4可知1號兔抗血清的效價大于128,000，2號兔抗血清效價大于256,000．

圖4 間接ELISA法測定抗血清的效價Fig. 4 ELISA test results of anti-FABI2 polyclonal antiserum

2.5 免疫印跡法檢測抗血清靈敏度和特異性

本研究對4次免疫后經過Protein A純化的抗血清進行免疫印跡，結果如圖 5所示，在 5.4×104處出現單一的特異性條帶，證明抗血清與 FABI2蛋白特異性結合良好．

圖5 免疫印跡法驗證抗體特異性Fig. 5 Antibody specificity detected by Western blot

3 結 語

設計帶有 BamHⅠ和 HindⅢ酶切位點的引物，從實驗室已有的 pET-28b-FABI2質粒中擴增出目的片段后，構建帶有 GST標簽的表達載體．通過摸索合適的誘導條件，發現在 0.1,mmol/L IPTG、20,℃、185,r/min條件下誘導 6,h，pET-28b-FABI2和 pGEX-2T-FABI2質粒分別在2.8×104和5.4×104處大量表達蛋白，且集中在上清液中．由于表達的蛋白為水溶性，因此純化得到的融合蛋白空間結構完好．除此之外，選擇 6×His-FABI2融合蛋白作為免疫用抗原，由于其標簽相對分子質量小，因此與 GST標簽相比而言，免疫動物產生的免疫反應更?。?次免疫后測效價，合格后股動脈取血．最后對血清進行Protein A親和純化并進行特異性檢驗，發現血清可與 FABI2蛋白特異性結合，標志著多克隆抗體制備成功．在進行免疫印跡法檢測時，以所得的抗體為一抗，另一個標簽的抗原進行上樣，排除了His標簽產生的抗體對標簽的識別作用．后續將會采用免疫熒光技術對該抗體進行定位．