蒿鱉養陰軟堅方對TGF-β1誘導的肝纖維化的作用

唐詩慧，張 麗，方步武

（天津醫科大學藥理學系，天津300070）

肝纖維化是細胞外基質過度沉積的動態進行性過程，是由多種慢性肝病共同作用的結果，其發病率在全世界范圍內呈現不斷上升的趨勢[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化并增殖，導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成與降解失衡并最終導致肝纖維化[2]。轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β1） 是介導肝纖維化最重要的細胞因子，與細胞外基質的代謝和肝纖維化的發生發展有著密切的關系[3]。TGF-β1對HSCs的激活、增殖、轉化具有極其重要的意義，是最強的促纖維化細胞因子[4]。本實驗采用的蒿鱉養陰軟堅方是由青蒿、鱉甲、知母、白花蛇舌草、虎杖、大黃等九味中藥組成，此中藥復方配伍有良好的益氣活血、清熱利濕、軟堅散結功效，對治療慢性肝病、肝纖維化有良好的療效[5]。本課題組前期工作已證明蒿鱉養陰軟堅方先水后醇（60%）提取方案對LX-2細胞具有良好的抑制作用，本實驗進一步優化復方提取工藝。以TGF-β1刺激LX-2細胞，給予蒿鱉養陰軟堅方治療，初步探討進一步優化提取工藝后的蒿鱉養陰軟堅方對LX-2細胞的影響，旨在揭示蒿鱉養陰軟堅方抗纖維化的藥物作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株LX-2細胞株由北京地壇醫院提供。

1.1.2 主要試劑 Recombinant Human TGF-beta1-Mammalian購于美國PeproTech公司，產品編號100-21-10。Anti-α-Smooth Muscle Actin antibody購于美國Cell Signaling Technology公司，產品編號19245T。Rabbit Anti-Collagen I antibody購于北京博奧森生物技術有限公司，產品編號：bs-0578R。BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）購于江蘇碧云天生物技術研究所，產品編號：P10010。Anti-β-actin、山羊抗兔抗體、LDH試劑盒以及ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。DMEM以及胎牛血清均購于美國Gibco公司。

1.1.3 主要儀器 680酶標儀（美國BIO-RAD公司），CO2恒溫培養箱（美國 NAPCO series5400），DL-CJ-2NDI潔凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造公司），WD-9405A型脫色搖床（北京六一儀器廠），湘儀L420低速自動平衡離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），垂直電泳槽（美國BIO-RAD公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組處理 從液氮中取出細胞并復蘇，將細胞置于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中進行細胞培養。細胞密度長至培養瓶底90%時，棄去培養液，PBS沖洗3次，加入1 mL 0.25%胰酶，消化1 min，離心后按照1:3的比例進行傳代，取對數期細胞進行后續實驗。本實驗分成5組，分別為（1）control組：細胞對照組；（2）TGF-β1 刺激組（2 ng/mL），作用24 h；（3）不同濃度蒿鱉養陰軟堅方處理組（0.5、1、2 mg/mL），作用 24 h。

1.2.2 復方提取 將鱉甲、青蒿、地黃等九味中藥按照特定比例稱取，復方總重141.6 g。先將鱉甲用840 mL三蒸水在微沸狀態下回流提取2 h，加入其它剩余藥材浸泡2 h，然后在微沸狀態下再回流提取1 h，收集水提取液。840 mL的95%乙醇繼續回流提取2次，每次0.5 h，收集醇提取液，并與水提取液混合后旋蒸濃縮，濃縮液冷凍干燥至恒重，備用。

1.2.3 MTT比色法檢測LX-2細胞增殖情況 取處于對數期的LX-2細胞接種于96孔板中，根據細胞實驗設計分別對每組細胞進行處理，每組設5個副孔。24 h后，每孔加入20 μL MTT，混勻后放回培養箱中繼續孵育4 h，棄去培養液，每孔加入20 μL DMSO，振蕩10 min，在490 nm處測定各孔吸光度值（A值），計算細胞抑制率（inhibition rate,IR）。抑制率計算公式：抑制率（%）=［（對照組吸光度值-實驗組吸光度值）/對照組吸光度值］×100%。

1.2.4 細胞培養液中Hyp含量測定 根據實驗設計處理后，收集96孔板中細胞培養液?？瞻坠苤屑尤?.5 mL雙蒸水，標準管中加入0.5 mL標準液，每個測定管中加入0.5 mL的待測樣本，所有管中加入0.05 mL的消化液，混勻，37℃水浴3h。所有管加入試劑盒中試劑一0.5mL室溫靜置10min，試劑二0.5 mL室溫靜置5 min，試劑三1 mL 60℃水浴15 min，流水冷卻后3 500 r/min，離心10 min，取上清在550 nm處測定各管吸光度。羥脯氨酸含量（μg/mL）=（測定OD值-空白OD值/標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（5 μg/mL）×樣品測試前稀釋倍數。

1.2.5 細胞培養液中LDH活性測定 根據實驗設計處理后，收集細胞培養液備用。按照碧云天生物研究所乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒說明書進行操作。LDH活性=（樣品孔吸光度－背景空白對照孔吸光度）/（標準管吸光度－標準空白管吸光度）×標準品濃度（mU/mL）。

1.2.6 Western blot法檢測 collagen Ι、α-SMA 蛋白的表達 取對數期細胞以5×104個/mL單個細胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL。根據實驗設計處理后，棄去培養液，PBS沖洗3遍，每孔加入80μLRIPA蛋白裂解液，冰浴條件下使其充分裂解提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后取20 μg蛋白上樣，8%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF上，室溫條件下5%的脫脂奶粉封閉2 h。4 ℃下搖床孵育一抗（collagen Ι 1∶500、α-SMA 1∶1000）過夜。次日，TBST洗膜3次，每次5min，室溫下孵育二抗2 h。ECL化學發光試劑盒顯色，采用Image J軟件對蛋白條帶的光密度值進行分析。

2 結果

2.1 蒿鱉養陰軟堅方對LX-2細胞增殖的影響 與對照組相比，2 ng/mL的TGF-β1作用于細胞24 h，細胞明顯增殖（P＜0.05）。與 TGF-β1刺激組相比，不同濃度的蒿鱉養陰軟堅方（藥物終濃度為0.5、1、2 mg/mL）作用24 h后，對LX-2細胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），且隨著濃度增大，抑制作用越明顯，表現出一定程度的劑量依賴性（表1）。

表1 蒿鱉養陰軟堅方對LX-2細胞增殖的影響(±s，n=5)Tab 1 Effects of HBYYRJF on the proliferation of LX-2 cells(±s，n=5)

表1 蒿鱉養陰軟堅方對LX-2細胞增殖的影響(±s，n=5)Tab 1 Effects of HBYYRJF on the proliferation of LX-2 cells(±s，n=5)

與對照組比較，*P＜0.01；與 TGF-β1 處理組比較，#P＜0.05；與HBYYRJ（0.5 mg/mL）組比較，ΔP＜0.05；與 HBYYRJ（1 mg/mL）組比較，◇P＜0.05

組別/(mg/mL)對照組TGF-β1刺激組HBYYRJ 0.5 HBYYRJ1 HBYYRJ 2抑制率/%--15.59±0.97*21.11±0.86*#33.15±1.54#Δ 49.611±1.86#Δ◇

2.2 蒿鱉養陰軟堅方對細胞培養液LDH活性的影響 不同濃度的蒿鱉養陰軟堅方作用于LX-2細胞24 h后，與對照組相比，上清中LDH活性無明顯改變，差異無統計學意義（P＞0.05，表2、圖 1）。

表2 蒿鱉養陰軟堅方對細胞上清中LDH活性的影響(±s，n=3)Tab 2 Effects of HBYYRJ on the activity of LDH(±s，n=3)

表2 蒿鱉養陰軟堅方對細胞上清中LDH活性的影響(±s，n=3)Tab 2 Effects of HBYYRJ on the activity of LDH(±s，n=3)

與對照組比較，*P＞0.05

組別/(mg/mL)對照組HBYYRJ 0.5 HBYYRJ 1 HBYYRJ 2 LDH活性/mU/mL 0.09±0.009 0.095±0.015*0.103±0.019*0.101±0.018*

圖1 蒿鱉養陰軟堅方對細胞上清中LDH活性的影響（±s，n=3）Fig 1 Effects of HBYYRJ on the activity of LDH（±s，n=3）

2.3 蒿鱉養陰軟堅方對細胞培養液Hyp含量的影響 不同濃度蒿鱉養陰軟堅方作用于LX-2細胞24 h后，與模型組相比，各劑量組細胞上清液中羥脯氨酸含量明顯降低，且劑量越大，羥脯氨酸含量越低，差異具有統計學意義（P＜0.05，表3、圖2）。

表3 蒿鱉養陰軟堅方對Hyp含量的影響(±s，n=3)Tab 3 Effects of HBYYRJ on the content of Hyp(±s，n=3)

表3 蒿鱉養陰軟堅方對Hyp含量的影響(±s，n=3)Tab 3 Effects of HBYYRJ on the content of Hyp(±s，n=3)

與對照組比較，*P＜0.01；與 TGF-β1 刺激組比較，#P＜0.05

組別/(mg/mL)對照組TGF-β1刺激組HBYYRJ 0.5 HBYYRJ 1 HBYYRJ 2 Hyp(μg/mL)1.34±0.15 2.10±0.31*1.69±0.13#1.56±0.14#1.50±0.18#

圖2 蒿鱉養陰軟堅方對Hyp含量的影響（±s，n=3）Fig 2 Effects of HBYYRJ on the content of Hyp（±s，n=3）

2.4 蒿鱉養陰軟堅方對collagen Ι和α-SMA蛋白水平的影響 見圖3、4。

圖3 蒿鱉養陰軟堅方對LX-2細胞collagenΙ表達的影響（±s，n=3）Fig 3 Effects of HBYYRJ on the expression level of collagen Ι（±s，n=3）

圖4 蒿鱉養陰軟堅方對LX-2細胞α-SMA表達的影響（±s，n=3）Fig 4 EffectsofHBYYRJontheexpressionlevelof α-SMA（±s，n=3）

3 討論

肝纖維化大多發生在各種慢性肝損傷后，是肝臟對于各種慢性刺激損傷進行自我修復的病理過程。肝纖維化的過程是可逆的，但如果不控制肝纖維化任其發展，將會形成肝纖維結節及肝臟結構和功能異常，最終導致肝硬化甚至肝癌[6]。肝纖維化發生最為關鍵的一步是HSC的活化和增殖[7]。TGF-β1是目前已知最強的促肝纖維化細胞因子[8]。HSCs在TGF-β1的作用下活化增殖，并且促進細胞外基質Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原的產生進而使得肝纖維化進一步發生發展[9]。本實驗應用蒿鱉養陰軟堅方能顯著抑制LX-2細胞的增殖，表明蒿鱉養陰軟堅方可通過抑制LX-2細胞增殖發揮抗纖維化的作用。羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的有效成分，肝纖維化時，活化的HSCs合成大量以膠原纖維為主的細胞外基質，測定培養液上清中羥脯氨酸含量可換算成HSCs產生膠原蛋白的含量，以反映肝纖維化的程度[10]。蒿鱉養陰軟堅方能顯著降低羥脯氨酸含量。α-SMA是HSCs活化的標志，在肝纖維化研究中被廣泛應用，α-SMA的表達隨著肝纖維化的加重而增加[11]。本實驗通過測定LX-2細胞中α-SMA的表達來反映肝纖維化的程度。實驗結果顯示，蒿鱉養陰軟堅方降低α-SMA蛋白水平，表明蒿鱉養陰軟堅方能抑制LX-2細胞活化，從而發揮抗肝纖維化的作用。

中藥在治療肝纖維化方面有其獨特的優勢，中藥復方多成分、多靶點的特點正好應對肝纖維化復雜的發病機制。蒿鱉養陰軟堅方主要是由鱉甲、青蒿、地黃等九味中藥構成，具有多種藥理作用。本實驗探究蒿鱉養陰軟堅方對LX-2細胞增殖，細胞產生羥脯氨酸含量以及相關蛋白表達的影響，發現蒿鱉養陰軟堅方具有良好的抗肝纖維化作用。

本研究結果顯示，蒿鱉養陰軟堅方通過抑制HSCs的激活增殖和細胞外基質的沉積減輕TGF-β1誘導的肝纖維化，為臨床治療肝纖維化提供了新的理論依據。