同型半胱氨酸對自發性高血壓大鼠腦組織損傷免疫調節機制的研究

張 宇，李 新，冷 曉，王 林

（天津醫科大學第二醫院干部保健科,天津市老年病學研究所,天津300211)

高血壓是老年常見疾病之一，隨著人均壽命的延長，老年人日益增多，老年高血壓患者也相繼增多，老年高血壓的防治研究已成為醫學界十分關注的問題。血清同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平是心血管疾病的重要標志之一[1]。大量動物實驗證實，高蛋氨酸攝入可引發高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)。伴有 Hcy 升高的高血壓病（H型高血壓）患者，其心腦血管疾病發生風險較血漿Hcy水平正常患者發生風險升高，當Hcy超過18 μmol/L以后，高血壓風險是不伴有Hcy升高患者的3倍之多；而對于缺血性腦病患者而言，再次出現腦血管意外的風險增加，且再次出現腦血管意外后癥狀更加嚴重[2-3]。高血壓腦損傷免疫失調機制是近年來的研究熱點[4-5]。機體調節性T（regulatory T，Treg）細胞/輔助性 T（helper T，Th）細胞受 Hcy 作用后出現比例失調，進而介導炎癥反應增加，是高血壓免疫損傷的基礎[6]。但是，Th17和Treg細胞在腦缺血炎性反應發生中的作用尚存在爭議[7]。心腦血管疾病尤高血壓患者血漿同型半胱氨酸高于正常人，而葉酸、維生素B6（vitamin B6，VB6）、維生素B12（vitamin B12，VB12）水平低于正常人。Hcy 能夠提高血腦屏障通透性，聯合維生素治療可降低血漿Hcy水平，保護血腦屏障[8-9]。本文旨在觀察伴HHcy的SHR補充葉酸、VB6和VB12前后血壓、血漿IL-10、IL-17水平、腦組織細胞因子表達情況及光鏡下Th17和Treg細胞變化情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60只雄性自發性高血壓（spontaneously hypertensive rats，SHR）大鼠，8 周齡，體質量 193.3～243.2 g（平均 222.9 g），購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。本研究已獲天津醫科大學第二醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 Rat Interleukin 17（IL-17）ELISA kit和 Rat Interleukin 10（IL-10）ELISA kit購自美國R&D公司，實時定量熒光PCR試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）購自美國 Roche公司，二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DBA）顯色試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。蘇木素伊紅染料購自北京中杉金橋生物技術有限公司，所用抗體購自美國 Abcam 公司，Trizol、Hcy、葉酸、VB6、VB12等購自美國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 7500B全自動生化儀購自美國ABI公司，泰盟BP-100A全自動大小鼠無創血壓測量系統購自成都泰盟軟件有限公司，ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，Multiskan FC多功能酶標儀購自英國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 動物處理方案 按照隨機數字表法將動物隨機分為SHR-C、SHR-M以及SHR-T，每組20只。SHR-C普通飼料喂養，SHR-M給予2 mg/（kg·d）高蛋氨酸飲食，連續16周。SHR-T組前8周給予2 mg/(kg·d)高蛋氨酸飲食，第9周開始給予普通飼料喂養，并給予葉酸4 mg/(kg·d)、維生素B12（vitamin B12，VB12）0.09 mg/（kg·d）、維生素B6（vitamin B6，VB6）0.09 mg/（kg·d）灌胃治療，直至16周。根據每只大鼠的公斤體質量計算其藥物劑量，并依照體質量變化及時調整劑量。分別于第0、8、16周進行大鼠尾靜脈穿刺取血，每次取血500～800 μL。第8周時，每組大鼠隨機選取10只，麻醉后處死，摘取全腦。第16周時，將剩余的3組大鼠全部處死，摘取全腦。

1.2.2 體質量、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和血漿Hcy濃度檢測 分別于第0、8、16周記錄大鼠安靜狀態下的體質量，在大鼠清醒狀態下用無創血壓測量系統檢測收縮壓（systolicbloodpressure，SBP）。用全自動生化儀檢測大鼠血漿Hcy濃度，每次測定所需樣本量為100～150μL血漿。每次檢測重復3次。

1.2.3 ELISA 應用ELISA方法于實驗第8周及第16周測量大鼠血漿IL-17及IL-10濃度。大鼠鼠尾取血，離心取血漿嚴格按照試劑盒使用說明，采用ELISA檢測3組大鼠血漿中IL-17和IL-10的蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.2.4 實時定量PCR（real time quantitative PCR，QPCR） 取實驗第8周及第16周大鼠腦組織用QPCR檢測3組大鼠腦組織中IL-17和IL-10的mRNA表達水平。將腦組織置于液氮預冷的研缽中研碎，用Trizol提取總RNA，并逆轉錄成cDNA。所有引物委托上海生工生物工程股份有限公司設計并合成。IL-17引物序列：上游5′-GCA GCG GTA CTC ATC CCT CAA-3′，下 游 5′-TCA TTG CGG CTC AGA GTC CAG-3′。IL-10 引物序列：上游 5′-ACG CTG TCA TCG ATT TCT CCC-3′，下游 5′-TCC CAC ACT CCA GGT TCG GTC-3′。β-actin 引物序列：上游 5′-TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA-3′，下游 5′-AGC ACT GTG TTG GCA TAG AGG-3′。反應體系：選擇25μL體系，分別加入SYBR12.5 μL、cDNA 2 μL、上游及下游引物各 1.5 μL，用水補足至25 μL；反應條件：預變性95℃15 min、95℃變性20 s、57℃退火 20 s、57℃ 延伸 35 s，循環數 40個。目的基因的相對定量結果用2-ΔΔCt表示。

1.2.5 免疫組織化學染色實驗 取第16周大鼠腦組織進行免疫組織化學染色。選擇Poly-Lysine浸泡載玻片，撈取組織切片后置烤箱58～60℃烤30～60 min，使切片緊密結合黏附，切片常規脫臘至水。30%過氧化氫1份加蒸餾水10份混合，室溫下5～10 min滅活內源性酶；蒸餾水沖洗3次。切片浸0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，高溫下維持5～10min，間隔5～10min，反復1～2次，以修復抗原。冷卻后磷酸鹽緩沖液（pH7.20-7.60）洗滌1～2次；5%牛血清白蛋白（BSA）封閉，室溫下20 min；滴加一抗，以試劑盒所附陽性切片作為陽性對照，另取切片以磷酸鹽緩沖液代替一抗（兔抗鼠IL-17和IL-10抗體）作為陰性對照；37℃1 h；磷酸鹽緩沖液沖洗2 min，共3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃共20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗2 min，3次；滴加試劑SABC，20～37℃反應20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min，4次。使用DAB顯色試劑盒混勻稀釋后加至切片，室溫下顯色12 min，蒸餾水洗滌終止反應；蘇木素輕度復染；脫水，透明，封片；400倍光學顯微鏡下觀察胞漿呈紅色染色的陽性細胞。

1.3 數據統計 采用SPSS 17.0軟件包對實驗數據進行統計學分析。計量資料以±s表示。兩組間的比較采用配對t檢驗，3組間比較采用F檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組SHR大鼠的體質量、SBP、血漿Hcy濃度測定結果 0周時，3組SHR大鼠的體質量、SBP和血漿Hcy濃度沒有統計學差異（P＞0.05）。8周時，SHR-M和SHR-T的體質量顯著低于SHR-C，血漿Hcy濃度顯著高于SHR-C組（P＜0.05）；SHR-M和SHR-T的體質量、SBP和血漿Hcy濃度沒有統計學差異（P＞0.05）。16周時，經治療后SHR-T組的體質量升高、血漿Hcy濃度下降，與SHR-M組比較具有統計學意義（P＜0.05）。此外，第 0、8、16周時，3組大鼠的SBP沒有顯著差異（P＞0.05）。詳見表1。

表1 3組SHR大鼠的體質量、SBP、血漿Hcy濃度測定結果（±s，n=3）Tab 1 Body weight,SBP and serum Hcy in three groups（±s，n=3）

表1 3組SHR大鼠的體質量、SBP、血漿Hcy濃度測定結果（±s，n=3）Tab 1 Body weight,SBP and serum Hcy in three groups（±s，n=3）

*:3 組間 P＜0.05；a:與 SHR-C 比較，b:與 SHR-M 相比較，P ＜0.05

體質量/g S B P/（m m H g）H c y/（μ m o l/L）0周 8周 1 6周 0周 8周 1 6周 0周 8周 1 6周S H R-C 2 2 3.6 1±8.7 6 3 2 9.8 2±9.2 1 3 5 5.2 1±1 0.3 2 1 6 5.4 1±6.1 1 1 8 6.3 3±8.7 6 1 9 4.1 2±8.1 4 2 8.2 4±0.8 9 2 6.2 6±0.7 6 2 8.3 6±0.5 4 S H R-M 2 2 4.8 2±9.7 8 2 9 0.9 1±1 0.7 6 a 2 6 6.3 2±1 1.2 4 a 1 6 8.2 2±7.0 1 1 9 7.3 4±1 1.0 8 2 1 4.5 2±1 2.3 2 2 8.7 4±1.8 6 3 9.2 3±2.8 8 a 4 8.2 2±3.2 4 a S H R-T 2 2 0.3 4±8.1 2 2 9 4.6 1±9.8 6 a 3 3 8.8 4±9.6 6 b 1 6 7.1 2±6.8 5 2 0 1.4 1±9.6 4 1 8 6.2 3±8.1 7 2 8.6 0±1.6 7 3 9.1 1±2.0 1 a 2 7.0 2±0.8 6 b F 0.1 4 9.2 9* 1 3.8 6* 0.0 9 1.2 5 4.4 9 1.6 7 1 6.3 4* 3 2.8 1*

2.23組SHR大鼠的血漿IL-17及IL-10測定 SHRT組的血漿IL-17濃度降低、IL-10濃度升高，然而SHR-M組的血漿IL-17濃度繼續升高、IL-10濃度繼續降低，SHR-M和SHR-T組血漿IL-17和IL-10濃定結果 8周時，SHR-M和SHR-T的血漿IL-17濃度顯著高于SHR-C，IL-10濃度顯著低于SHR-C（P＜0.05）；SHR-M 和 SHR-T 的血漿 IL-17和 IL-10濃度沒有顯著差異（P＞0.05）。16周時，經治療后濃度具有顯著差異（P＞0.05）。

表2 3組SHR大鼠的血漿IL-17及IL-10測定結果（±s，n=3）Tab 2 ELISA result of IL-17/IL-10 in three groups（±s，n=3）

表2 3組SHR大鼠的血漿IL-17及IL-10測定結果（±s，n=3）Tab 2 ELISA result of IL-17/IL-10 in three groups（±s，n=3）

*:3 組間 P＜0.05；a:與 SHR-C 比較，b:與 SHR-M 相比較，P ＜0.05

分組IL-17/（μmol/L）IL-10/（μmol/L）8周 16周 8周 16周SHR-C 22.91±1.23 24.22±3.86 40.52±0.89 41.31±1.01 SHR-M 39.41±1.14a 72.82±2.88a 26.33±1.21a 18.63±0.67a SHR-T 41.63±1.31a 28.63±1.74b 26.71±0.76a 52.75±4.23ab F 138.61* 165.34* 138.42* 93.46*

2.3 3組SHR大鼠的腦組織IL-17及IL-10 mRNA的表達 8周時，SHR-M和SHR-T的腦組織 IL-10表達水平顯著低于 SHR-C（P＜0.05），SHR-M和SHR-T的IL-10表達水平差異沒有統計學意義（P＞0.05），3組間腦組織IL-17表達水平沒有顯著差異（P＞0.05）。16周時，SHR-T組腦組織IL-17表達水平顯著低于SHR-M組，IL-10表達水平顯著高于SHR-M組（P＞0.05）。

表3 3組SHR大鼠的腦組織IL-17及IL-10測定結果（x=2-ΔΔCt，±s，n=3）Tab 3 IL-17/IL-10 mRNA expression in brain tissue of three groups（x=2-ΔΔCt，±s，n=3）

表3 3組SHR大鼠的腦組織IL-17及IL-10測定結果（x=2-ΔΔCt，±s，n=3）Tab 3 IL-17/IL-10 mRNA expression in brain tissue of three groups（x=2-ΔΔCt，±s，n=3）

*:3組間 P＜0.05；a:與 SHR-C 比較，b:與 SHR-M 相比較，P ＜0.05

分組IL-17/（μmol/L）IL-10/（μmol/L）8周 16周 8周 16周SHR-C 2.29±0.33 2.31±0.36 4.21±0.84 4.15±0.71 SHR-M 3.03±0.64 4.26±0.77a 2.24±0.41a 1.26±0.17a SHR-T 3.11±0.61 2.32±0.24b 2.35±0.43a 4.65±0.73b F 1.38 9.708* 6.94* 18.84*

2.4 3組SHR大鼠的腦組織IL-17及IL-10免疫組織化學染色結果 3組SHR大鼠的腦組織IL-17及IL-10免疫組織化學染色結果見圖1。由圖1可以看出，16周時，SHR-M的腦組織IL-17細胞陽性率明顯高于SHR-C和SHR-T，IL-10細胞陽性率明顯高于SHR-C和SHR-T。

圖1 3組SHR大鼠的腦組織IL-17及IL-10免疫組織化學染色結果（×200）Fig 1 Immunohistochemical staining of IL-17/IL-10 in brain tissue of three groups（magnification×200）

3 討論

蛋氨酸去甲基后可以形成Hcy，葉酸、VB6和VB12是蛋氨酸代謝過程中重要的輔酶。Hcy的代謝異常導致血清中Hcy濃度升高，稱為高同型半胱氨酸血癥。Hcy是風濕性關節炎的獨立危險因素，亦是高血壓患者靶器官損害的獨立危險因素。Hcy與血管疾病關系密切，特別是腦梗死及腦出血[10]。Hcy通過氧化應激、炎癥反應、損害血管內皮、激活血小板及促進平滑肌細胞增殖等多種機制促進風濕性關節炎的發生和發展[11]。Hcy與高血壓發揮協同作用，可致血管疾病的風險明顯增加[12]。本研究對高血壓大鼠進行高蛋氨酸飲食造成高血壓合并HHcy模型，并用葉酸聯合維生素干預模型，進而研究Hcy對高血壓的影響。結果顯示，8周時高蛋氨酸飲食的SHR-M和SHR-T血漿Hcy濃度顯著高于正常飲食的SHR-C（P<0.05）。此結果說明8周時SHR大鼠的HHcy模型建立成功。葉酸、VB6和VB12治療后SHR-T組的血漿Hcy濃度下降到正常水平，繼續進行高蛋氨酸飲食的SHR-M組的血漿Hcy繼續升高，并且顯著高于SHR-T和SHR-C組（P<0.05）。該結果說明葉酸聯合B組維生素能夠有效降低SHR合并HHcy模型大鼠的血漿Hcy水平。此外，高蛋氨酸飲食影響SHR大鼠的體質量，我們的研究發現8周時，SHR-M和SHR-T的體質量顯著低于SHRC，治療后SHR-T組的體質量升高。

關于高同型半胱氨酸血癥對腦血管系統疾病的影響機制具有很多研究，包括動脈粥樣硬化、埃爾茨海默癥、帕金森綜合征、中風等。徐志紅等[13]認為同型半胱氨酸能引起人臍靜脈內皮細胞炎癥因子的表達與釋放,這些生物學效應是通過核轉錄因子κB信號通路來實現的。孔煒等[14]發現免疫細胞介導的氧化應激和炎癥反應在早期動脈粥樣硬化形成中的重要作用。本研究重點研究高同型半胱氨酸對自發性高血壓大鼠腦損傷的免疫調控機制。IL-10來源于Th2和部分Treg細胞，能抑制Th1細胞應答及合成細胞因子，是近年來發現的免疫抑制因子和抗炎因子，在機體中主要起免疫調節和抗炎作用，能抑制炎癥細胞因子的表達，可促進NO的合成，還能通過抑制炎癥介質誘導NO的釋放發揮抗炎癥效應[15-16]。Th17細胞主要效應因子是IL-17，IL-17是一種主要由活化的T細胞產生的致炎細胞因子，可以促進T細胞的激活和刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生多種細胞因子如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)和化學增活素及細胞黏附分子1(cellular adhesion molecule 1，CAM-1)，從而導致炎癥的產生[17-18]。Chastain 等[19]的研究表明高同型半胱氨酸可以加重腦脊髓炎的臨床癥狀，其機理可能同Hcy破壞血腦屏障，促進TH1細胞分泌TNF-α、IFN-γ等致炎因子有關。我們的結果顯示：第8周時，高蛋氨酸飲食的SHR-M和SHR-T組血漿和腦組織中的促炎因子IL-17濃度均顯著高于正常飲食組SHR-C，血漿和腦組織中的抑炎因子IL-10水平均低于SHR-C；16周時，經葉酸聯合維生素治療后SHR-T組血漿和腦組織中的促炎因子IL-17降低，抑炎因子IL-10水平升高，并且免疫組化也得到類似結果。因此，我們推測Hcy通過調節炎性反應進而影響高血壓患者的腦組織病變。即Hcy可促進炎癥反應從而導致腦組織病變的發生，下調免疫反應后可起到保護作用。