小兒退熱合劑定性定量研究

王 迅 鄒愷平 周琴妹 張 源

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

小兒退熱合劑為江蘇省中醫(yī)院兒科用藥，由荊芥、防風(fēng)、黃柏、鉤藤、大黃等中藥組成，功效辛涼解表、祛風(fēng)退熱，用于上呼吸道感染、流行性感冒之發(fā)熱癥[1-2]，作為江蘇省中醫(yī)院特色醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，臨床療效十分顯著。為進(jìn)一步提高制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)在小兒退熱合劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)方中黃柏和鉤藤進(jìn)行了薄層定性鑒別研究，并對(duì)大黃中5種蒽醌類成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)行了含量測(cè)定研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥材與試劑 黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)：121510-201105），鹽 酸 黃 柏 堿 對(duì) 照品（批號(hào)：111895-201202），異構(gòu)藤堿對(duì)照品（批號(hào)：111927-201102），蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-201007），大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-200206），大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110），大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201118），大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201013），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。荊芥（批號(hào)：140202），防風(fēng)（批號(hào)：131016），黃柏（批號(hào)：131122），石膏（批號(hào)：131210），鉤藤（批號(hào)：140225），薄荷（批號(hào)：140312），大黃（批號(hào)：131116），以上飲片均購(gòu)自南京松齡中藥飲片有限公司。小兒退熱合劑（批號(hào)：1601001、1601002、1601003），由江蘇省中醫(yī)院制劑部生產(chǎn)。

1.2 主要儀器 高效液相色譜儀（1260S型，美國(guó)Agilent公司）；凝膠成像分析儀（型號(hào)WD-9413A，北京市六一儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)DHG-9123A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器廠）；醫(yī)用超聲波清洗儀（型號(hào)KQ-1000E，昆山市超聲儀器有限公司）；萬(wàn)分之一電子天平（AX224ZH/E，美國(guó)OHAUS Corp）；十萬(wàn)分之一電子天平（AR2140型，美國(guó)OHAUS Corp）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃柏的薄層鑒別 供試品溶液制備：取小兒退熱合劑10mL，蒸干，加1%醋酸甲醇溶液50mL，于60℃超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至2mL作為供試品溶液。陰性供試品溶液制備：制備不含黃柏的小兒退熱合劑，同供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。對(duì)照品溶液制備：取鹽酸黃柏堿對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液作為對(duì)照品溶液。對(duì)照藥材溶液制備：取黃柏對(duì)照藥材0.1g，加1%醋酸甲醇20mL于60℃超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至2mL作為對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種試液各3～5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4）的下層溶液為展開劑，置于氨蒸汽飽和展開缸展開，取出，晾干，噴稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1。

2.1.2 黃柏鑒別方法的耐用性考察 取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各5μL，分別同時(shí)點(diǎn)于兩硅膠板上，按建立的薄層鑒別條件，分別在溫度10℃、濕度32%和溫度35℃、濕度72%條件下展開，取出，晾干，顯色。結(jié)果顯示，分離度較好，重現(xiàn)性好，見圖1。

2.1.3 鉤藤的薄層鑒別 供試品溶液制備：取小兒退熱合劑30mL，加濃氨試液15mL和三氯甲烷50mL，加熱回流2h，放冷靜置，取三氯甲烷層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，即得。陰性供試品溶液制備：制備不含鉤藤的小兒退熱合劑，同供試品溶液制備方法制得陰性供試品溶液。對(duì)照品溶液制備：取異鉤藤堿對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品及陰性供試品溶液各10～30μL，對(duì)照品溶液5μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（6∶4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖2。

2.1.4 鉤藤鑒別方法的耐用性考察 取上述供試品溶液15μL、對(duì)照品溶液5μL，分別同時(shí)點(diǎn)于兩硅膠板上，按建立的薄層鑒別條件，分別在溫度10℃、濕度32%和溫度35℃、濕度72%條件下展開，取出，晾干，顯色。結(jié)果顯示，分離度較好，重現(xiàn)性好，見圖2。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含蘆薈大黃素352.9μg、大黃酸728.8μg、大黃素324.2μg、大黃酚484.7μg，大黃素甲醚109.3μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液與陰性供試品溶液制備 取本品1mL置具塞錐形瓶中，加8%鹽酸溶液10mL，超聲（功率280W，頻率50kHz）10min，加入三氯甲烷10mL，加熱回流1h，放冷，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，再加三氯甲烷10mL，振搖提取3次，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。同法制備陰性樣品。

2.2.3 色譜條件及專屬性考察 色譜柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（83∶17）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。結(jié)果見圖3，被測(cè)成分色譜峰分離度良好，陰性無(wú)干擾。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，制成含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的濃度分別為35.29、72.88、32.42、48.47、10.93μg/mL的混合對(duì)照品溶液，依次稀釋2、4、8、16、32倍。精密吸取上述溶液10μL，按照“2.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，得5種對(duì)照品的線性回歸方程，結(jié)果見表1。

2.2.5 精密度考察 精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算5種成分對(duì)照品的RSD分 別 為0.13%、0.20%、0.48%、0.24%、0.79%，RSD均小于5%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

圖1 小兒退熱合劑黃柏鑒別及溫濕度耐用性薄層圖譜

圖2 小兒退熱合劑鉤藤的鑒別及溫濕度耐用性薄層圖譜

圖3 HPLC色譜圖

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值。結(jié)果顯示5種成分的RSD分別為1.16%、1.00%、1.86%、1.42%、1.96%，均小于5%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定良好。

2.2.7 重復(fù)性考察 精密吸取同一批號(hào)（1601001）樣品1mL，共6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值。結(jié)果顯示5種成分的RSD分 別為0.91%、0.73%、0.77%、0.38%、1.09%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知含量的樣品（批號(hào)1601001）1mL，共6份，精密加入一定量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值，計(jì)算，結(jié)果見表2。

2.2.9 3批樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 定性鑒別 小兒退熱合劑的原標(biāo)準(zhǔn)中僅有理化鑒別項(xiàng)，本研究參考藥典及文獻(xiàn)的方法，對(duì)小兒退熱合劑中的黃柏和鉤藤進(jìn)行了薄層定性鑒別研究[3-4]。實(shí)驗(yàn)所得到的薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性未見干擾。在此基

礎(chǔ)上，本研究還對(duì)兩種方法進(jìn)行了不同溫濕度的耐用性考察，結(jié)果顯示方法的重現(xiàn)性好。因此，可以考慮將上述薄層定性鑒別方法列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)在薄層鑒別的過程中考察了不同點(diǎn)樣量及不同對(duì)照品（化學(xué)對(duì)照品和對(duì)照藥材）在薄層色譜圖上的效果，最終選擇了相對(duì)合適的點(diǎn)樣量和對(duì)照品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 含量測(cè)定 本研究的含量測(cè)定選用小兒退熱合劑中大黃的5種蒽醌類成分作為指標(biāo)成分，實(shí)驗(yàn)中考察了不同有機(jī)相（甲醇和乙腈）以及不同比例的流動(dòng)相的分離效果[5-7]，最終選擇了甲醇-0.1%磷酸溶液（83∶17）的流動(dòng)相比例，該條件下各峰分離度良好，且在較短時(shí)間內(nèi)（30min）全部出峰，可以較好地進(jìn)行測(cè)定。

表1 大黃中5種成分的線性關(guān)系表

表2 5種成分加樣回收率

表3 3批樣品中5種成分的含量測(cè)定 μg/mL

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在小兒退熱合劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上建立了黃柏和鉤藤的薄層色譜鑒別方法及大黃中5種蒽醌類成分的HPLC含量測(cè)定方法。建立的方法經(jīng)3批樣品驗(yàn)證考察，專屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾，靈敏度高，重現(xiàn)性好。今后的研究將進(jìn)一步建立黃柏、鉤藤等飲片成分同時(shí)測(cè)定的方法，可以更科學(xué)、更合理、更全面地進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。