低硒大鼠心肌組織中微小RNA的差異表達研究

高登峰，馮雁京，邢玉潔，牛小麟

克山病是一種原因未明的地方性心肌病，曾多次暴發流行，病死率較高［1］。硒是一種與人類健康息息相關的微量元素，與多種心血管疾病的發生、發展有關［2］。目前研究認為體內硒缺乏是克山病的重要發病原因之一，體內硒水平較低會引起左心室收縮功能下降，最終導致心力衰竭，但低硒與心功能不全的關系及具體機制尚不清楚［3-5］。近年研究發現，微小RNA（miRNA）在心臟發育及心臟病發生發展過程中發揮著重要作用，其已成為心血管疾病研究領域的熱點［6-7］。但低硒所致克山病是否存在miRNA異常表達尚不清楚。本研究擬給予低硒飼料制備低硒大鼠模型，并分析心肌組織中miRNA的差異表達，為克山病的發病機制研究及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只清潔級SD大鼠購自西安交通大學動物中心，3周齡，平均體質量（75±10）g；按照隨機數字表法將大鼠分為對照組、低硒組、補硒組，每組10只。

1.2 方法 對照組大鼠給予AIN-93標準飼料（西安交通大學動物中心提供）喂養，低硒組及補硒組大鼠均給予AIN-93 M（低硒）飼料（西安交通大學動物中心提供）喂養；3組大鼠均喂養14周。之后補硒組大鼠給予亞硒酸鈉溶液（南京通盈生物科技有限公司生產）0.05 mg·kg-1·d-1灌胃，對照組和低硒組大鼠則給予相同劑量蒸餾水灌胃；3組大鼠均連續灌胃3周。入組17周后腹腔內注射10%水合氯醛0.03 ml/100 g，麻醉滿意后處死3組大鼠，腹主動脈留取全血，采用2，3-二氨基萘熒光法檢測血清硒水平；采用Triage 腦鈉肽（BNP）快速檢測試驗檢測血漿BNP水平。

1.3 HE染色 留取3組大鼠部分心肌組織標本，采用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，厚度10 μm/片，之后按照HE標準流程進行染色，光鏡下觀察心肌組織形態學結構。

1.4 基因芯片測序 留取3組大鼠剩余心臟組織并迅速投入液氮20～30 s，置于-80 ℃環境下凍存，采用TRIzol試劑（Invitrogen公司生產）和Qiagen miRNeasy Mini Kit提取總RNA，使用NanoDrop 1000超微量分光光度計檢測RNA質量及數量，并通過凝膠電泳確定RNA完整性。采用miRCURY?Hy3?/Hy5?標記試劑盒（Exiqon，Vedbaek，Denmark）對miRNA進行標記，根據陣列說明書在miRCURYTMLNA陣列（v.16.0）上對Hy3TM標記的樣品進行雜交。采用洗滌緩沖液試劑盒（Exiqon）洗滌，400 r/min離心5 min，最后干燥。采用AXON GenePix 4000B生物芯片掃描儀掃描切片，采用Significant Analysis of Microarrays（SAM）v4.0軟件挑選差異表達基因，差異表達基因篩選標準：錯誤發現率（FDR）≤5%，Fold change＞2倍。miRNA表達的聚類分析采用每張芯片平均值歸一化后的數據，采用Cluster 3.0軟件進行聚類分析。

1.5 靶基因功能的顯著性分析 采用miRNA生物信息學分析軟件Targetscan和miRanda對芯片檢測的差異表達miRNA進行靶基因預測，選擇兩種軟件交集的靶基因。基于基因本體（gene ontology，GO）數據庫，應用DAVID軟件根據靶基因的功能富集程度進行GO顯著性分析；基于KEEG數據庫，應用DAVID軟件根據靶基因在信號通路中的富集程度進行Pathway顯著性分析。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR） 選取差異表達顯著的miRNA作為驗證基因，設計miRNA特異性反反錄引物和PCR引物。取500 ng總RNA，利用miRNA特異性反轉錄引物和oligo-dT16在反轉錄酶作用下反轉錄合成cDNA。以U6為內參，在冰上按照實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書進行反應體系配制。反應體系為20 μl：試劑盒中SYBR Premix Ex Taq 10 μl，cDNA 模板，引物 0.4 μmol/L，并使用RNase Free H2O溶解至20 μl。95 ℃預變性3 min，變性 95 ℃ 10 s、退火 67 ℃ 30 s、延伸 72 ℃ 30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算miRNA相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清硒和血漿BNP水平 3組大鼠血清硒和血漿BNP水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；低硒組和補硒組大鼠血清硒水平低于對照組，血漿BNP水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低硒組大鼠血清硒水平低于補硒組，血漿BNP水平高于補硒組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 HE染色結果 對照組大鼠心肌組織結構清晰，閏盤連接結構良好，肌絲排列、肌走形均正常（見圖1A）。低硒組大鼠肌纖維腫脹、排列紊亂（見圖1B），心肌細胞壞死、細胞核固縮（見圖1C），部分肌纖維斷續（見圖1D），部分地方可見小的心肌壞死灶，且壞死灶周圍伴有炎性浸潤（見圖1E）。補硒組大鼠心肌纖維較對照組輕度腫脹，但肌纖維排列基本整齊有序（見圖1F）。

2.3 miRNA表達差異及聚類分析 基因芯片測序結果顯示，3組大鼠共119個miRNA差異表達，共8種變化趨勢，其中低硒組較對照組上調、補硒組與對照組間無差異的miRNA共30個（見圖2趨勢1）；低硒組較對照組下調、補硒組與對照組間無差異的miRNA共10個（見圖2趨勢6），上述40個miRNA為硒敏感性miRNA。

2.4 靶基因功能的顯著性分析 GO功能富集分析結果顯示，上述40種差異表達miRNA靶基因功能主要富集于脂代謝、心臟發育、細胞黏附、血管發育、軸突導向、細胞遷移調控、輸尿管芽發育、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、細胞分化、有機氮化物反應、棕色脂肪分化、髓系祖細胞分化、細胞-基質黏附、細胞增殖調控、生物鐘節律，見圖3。靶基因投射的13條信號轉導通路為腎細胞癌、轉錄調節、多巴胺能突觸、焦點黏附、Rap信號通路、脂代謝、PPAR信號通路、Ras信號通路、Oxytocin信號通路、長期抑制、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、HTLV-1感染，見圖4。

表1 3組大鼠血清硒和血漿BNP水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum selenium level and plasma BNP level in the three groups

表1 3組大鼠血清硒和血漿BNP水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum selenium level and plasma BNP level in the three groups

注：BNP=腦鈉肽；與對照組比較，aP＜0.05；與低硒組比較，bP＜0.05

組別 只數 硒（mg/L） BNP（pg/ml）對照組 10 0.144±0.007 894.3±11.3低硒組 10 0.026±0.004a 1 436.4±121.7a補硒組 10 0.092±0.012ab 1 174.2±132.8ab F值 4.32 3.96 P值 0.02 0.03

2.5 實時熒光定量PCR結果 上述40個miRNA中表達上調最顯著的5個miRNA分別為miRNA-374、miRNA-16、miRNA-199a-5p、miRNA-195、miRNA-30e*，表達下調最顯著的3個miRNA分別為miRNA-3571、miRNA-675、miRNA-450a*。實時熒光定量PCR結果顯示，以對照組心肌組織miRNA為參照，補硒組大鼠心肌組織miRNA-374、miRNA-16、miRNA-199a-5p、miRNA-195、miRNA-30e*相對表達量低于低硒組，心肌組織miRNA-3571、miRNA-675、miRNA-450a*相對表達量高于低硒組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

3 討論

克山病的病因迄今尚未完全明確，主要包括微生物地球化學病因和生物病因。目前，流行病學研究證實，地方性克山病幾乎全部發生在低硒地帶，該地區患者頭發和血液中的硒明顯低于非病區居民，故認為克山病的發生與當地飲食中硒元素缺乏有關，而口服亞硒酸鈉后患者病情得到明顯緩解，提示補硒能預防克山病的發生［3，8］。本研究采用低硒飼料喂養大鼠以構建低硒模型，結果顯示，低硒組大鼠血清硒水平低于對照組和補硒組，提示低硒大鼠模型構建成功。

近期一項前瞻性隊列研究結果顯示，血清硒基線水平與急性冠脈綜合征患者病死率呈負相關，且低硒是其獨立危險因素［9］。動物實驗結果顯示，低硒與心功能惡化及心肌肥厚有關，其水平可伴心臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性降低而下降［10］。本研究結果顯示，低硒組大鼠血漿BNP水平高于對照組和補硒組，補硒組大鼠血漿BNP水平高于對照組，提示低硒大鼠存在心功能損傷。

表2 低硒組和補硒組大鼠心肌組織表達最顯著的8種miRNA相對表達量比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of 8 miRNA with the most significant differential expression in myocardium tissue between low-selenium group and selenium supplement group

表2 低硒組和補硒組大鼠心肌組織表達最顯著的8種miRNA相對表達量比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of 8 miRNA with the most significant differential expression in myocardium tissue between low-selenium group and selenium supplement group

組別 只數 miRNA-374 miRNA-16 miRNA-199a-5p miRNA-195 miRNA-30e*miRNA-3571 miRNA-675 miRNA-450a*低硒組 10 342.1±41.2 107.2±12.5 72.3±9.6 59.4±8.3 38.1±5.8 0.14±0.02 0.12±0.02 0.24±0.03補硒組 10 87.4±12.8 12.9±1.2 14.7±1.9 5.4±0.9 4.9±0.4 0.76±0.04 0.28±0.02 0.56±0.07 t值 10.31 8.24 9.02 5.42 4.12 3.92 3.65 5.21 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.01 0.02 0.03 0.03 0.01

圖1 HE染色結果Figure 1 HE staining results

圖2 3組大鼠miRNA變化趨勢圖Figure 2 miRNA change trends in the three groups

近年來，miRNA在心血管疾病領域的研究報道日益增多，其在高血壓、先天性心臟病、冠心病的發生發展中發揮著重要作用［8，11］。本研究通過基因芯片測序篩選出40個硒敏感性miRNA，包括30個表達上調的miRNA和10個表達下調的miRNA；進一步行GO功能富集分析結果顯示，上述40種差異表達miRNA靶基因功能主要富集于脂代謝、心臟發育、細胞黏附、血管發育、軸突導向、細胞遷移調控、輸尿管芽發育、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、細胞分化、有機氮化物反應、棕色脂肪分化、髓系祖細胞分化、細胞-基質黏附、細胞增殖調控、生物鐘節律，且靶基因主要投射13條信號轉導通路。為了驗證基因芯片測序結果，本研究選取8個表達顯著的miRNA，結果提示基因芯片測序結果與實時熒光定量PCR結果相一致。既往研究表明，miRNA在低硒所致克山病的發生發展中發揮著重要作用，其可能的作用機制為miRNA通過影響某種信號轉導通路而導致心臟結構或功能異常，最終發展為心力衰竭［12］。

圖3 差異表達miRNA靶基因GO功能富集分析結果Figure 3 Gene ontology functional enrichment analysis results of target gene of miRNA with differential expression

圖4 靶基因投射的信號轉導通路Figure 4 Target gene projected signal transduction pathways

綜上所述，低硒會導致大鼠心功能損傷，低硒大鼠心肌組織中存在多個差異表達的miRNA，主要涉及15種生物學功能和13條信號轉導通路，這些差異表達的miRNA可能參與克山病的發生發展。但本研究存在以下不足：（1）低硒大鼠模型并不能完全模擬和反映克山病的自然病程；（2）實驗大鼠數量較少；（3）芯片基因篩選時采用了樣本混合方法，以節約成本，但可能降低研究結論的可靠性。

作者貢獻：高登峰、牛小麟進行文章的構思與設計，對文章整體負責，監督管理；高登峰進行研究的實施與可行性分析；馮雁京進行數據收集、整理、分析；邢玉潔進行結果分析與解釋；高登峰、馮雁京負責撰寫論文。

本文無利益沖突。