反式剪接及其在哺乳動物中的作用

荊曉燕，張彩霞，宋艷芳，劉東宇，劉 娣，楊秀芹*

(1. 東北農業大學動物科技學院，哈爾濱 150030； 2. 黑龍江省農業科學院，哈爾濱 150086)

真核生物基因多數是斷裂的，由外顯子和內含子組成，轉錄時首先形成初始轉錄本——pre-mRNA，再經過剪接去掉內含子并把外顯子按照5′→3′的順序連接起來，得到成熟mRNA。傳統剪接發生于同一個pre-mRNA內部，成熟RNA的外顯子都來源于同一個初始轉錄本，稱為順式剪接(cis-splicing, CS)。反式剪接(trans-splicing, TS)則發生于不同的初始轉錄本之間，剪接產物是含有不同來源外顯子的嵌合RNAs。TS最早發現于低等真核生物，哺乳動物的相關研究起步較晚，近年來，第二代高通量測序技術的發展為TS鑒定提供了有力工具，TS及其產物在生命活動、疾病發生中的作用也逐漸得到重視。本文對TS概念、類型、產生機制及其在哺乳動物中的作用進行綜述。

1 反式剪接類型

TS可歸納為兩種類型：SL(spliced-leader)-型和非SL-型，非SL-型又包括基因內TS和基因間TS。SL-型TS只存在于低等真核生物，在脊椎動物中非SL-型取代了SL型，且發生的頻率顯著降低。SL-型TS與操縱子密切相關，有研究認為，隨著操縱子的丟失和基因組復雜性的增加，TS逐漸轉化為CS，說明剪接在生物進化過程中具有重要意義[1]。

1.1 SL-型反式剪接

SL-型TS是指來源于一個非編碼RNA(SL RNA)5′末端的前導序列被剪接到pre-mRNA的5′端，在產生的成熟mRNA中前導序列不具有編碼作用，故SL-型TS不影響原有mRNA的翻譯結果，該過程類似于高等生物基因的5′加帽，能夠提高mRNA穩定性，促進翻譯。SL RNA的前導序列也被稱為外顯子(SLe)，余下部分為內含子(SLi)。SLe的長度隨著物種的不同而改變，介于16～51 nt之間。同一個SLe可以與許多、甚至是物種內全部pre-mRNA進行TS，由此形成的成熟mRNA含有共同的5′末端。各物種SL RNA序列相似性不高，但都具有高甲基化的5′帽子結構、較短的SLe序列和莖環二級結構，并且莖環結構的一個配對區含有5′剪接位點(splice site, SS)和Sm蛋白結合位點[2]。

SL-型TS存在兩種類型：一種剪接發生于SLe和pre-mRNA的5′游離末端；此外，許多低等真核生物基因以操縱子形式存在，即多個基因共用一個啟動子，所以也存在著SL RNA和操縱子內部基因間的TS，剪接發生于SLe和pre-mRNA的5′非游離序列(圖1A)。有些生物(如錐體蟲)只有一種SL RNA參與所有的TS反應[3]；而在秀麗線蟲及其親緣種中，上述兩種TS反應分別由不同的SL RNA(SL1和SL2)負責，這可能是不同環境和發育階段下轉錄本差異表達的原因[4]。SL-型TS廣泛存在于低等真核生物中，錐體蟲每個蛋白編碼基因都會通過該方式形成SL帽狀RNA[3]。

a. 同一pre-mRNA的兩個拷貝或等位基因間的剪接；b. 同一基因座正反兩條鏈間的剪接。方框表示外顯子，不同顏色或背景的方框表示來自不同基因。tss. 反式剪接位點a. Trans-splicing between two copies of the same pre-mRNA or alleles; b. Trans-splicing between sense and antisense DNA at the same locus. Boxes indicate exon, those boxes with different colors or backgrounds indicate exons from different genes. Tss. Trans-splicing site圖1 反式剪接類型Fig.1 Types of trans-splicing

1.2 基因內反式剪接

基因內TS的初始轉錄本來源于同一個基因座，可發生于同一pre-mRNA的兩個拷貝、等位基因以及同一DNA分子兩條鏈的轉錄產物間(圖1B)，往往造成外顯子重復和正義-反義鏈融合[4]。在果蠅[5]和家蠶[6]中研究得比較透徹的mod(mdg)基因座能形成一系列基因內TS產物，這些成熟mRNAs的5′外顯子相同，均來自于同一個基因的5′端，家蠶是BGIBMGA006426基因的外顯子1～4；3′外顯子是可變的，分別來自于反向平行鏈的不同基因，家蠶中已鑒定了8個不同基因。家蠶的1個上游基因和8個下游基因產生了9種成熟mRNAs，其中兩個mRNAs的3′端來源于同一個基因，但外顯子組成不同(圖2)，這說明TS也存在著可變剪接。目前可變反式剪接(alternativetrans-splicing, ATS)還沒有統一的定義，筆者認為應該為兩個或多個特定的pre-RNAs分子經過TS形成多種嵌合RNAs的過程。mod(mdg)基因編碼產物在兩個物種間非常相似：5′外顯子編碼產生BTB(BR2C, ttk and bab)結構域；3′外顯子盡管來源于不同的基因，但都編碼產生保守的FLYWCH基序。家蠶9個成熟mRNAs均編碼產生317 aa殘基的蛋白質多肽鏈。大鼠COT(carnitine octanoyltransferase)基因cDNA的外顯子重復現象及產生機制分析，首次證明了哺乳動物中存在著自發的TS反應[7]；對綿羊T細胞受體β鏈(T cell receptor β-chain, TRB)基因座轉錄產物的克隆分析表明，在該區域存在著較高頻率的基因內TS事件，這也是其編碼蛋白功能復雜的原因之一[8]。

1.3 基因間反式剪接

基因間TS是不同來源的初始轉錄本間發生剪接，在pre-mRNA之間以及pre-mRNA和非編碼RNA之間都能發生；進行剪接的基因可位于同一條染色體上，也可位于不同染色體上(圖1C)。自二十世紀九十年代初期在胎鼠肝組織中發現基因間TS后[9]，這方面的研究逐漸增多，人、小鼠和果蠅中都鑒定到該現象。雖然一度被認為是轉錄組中的稀有事件，深度測序技術的普及應用及高性能生物信息學軟件的開發、完善，為在全轉錄組水平上進行TS的高通量鑒定提供了有效手段，大量基因間TS現象也隨之被鑒定，其在生命活動中的重要性正逐漸被揭示[10-12]。

基因間TS也存在著復雜的可變剪接現象。嵌合子ZC3HAV1L-CHMP1A的兩個親本基因分別位于人7和16號染色體上，兩個親本通過TS產生的嵌合子有5種可變轉錄本(圖2)，其中轉錄本a是主 要的ATS產物，廣泛表達于多種組織和細胞內，兩個親本基因為框內融合，預期可編碼產生融合蛋白；轉錄本a～d使用經典的SSs進行TS；轉錄本e的嵌合點位于ZC3HAV1L外顯子4末端和CHMP1A外顯子6內部，不符合GT-AG規則，在交界處存在著一個5 bp的正向重復序列，筆者認為其可能是轉錄過程中模板轉換導致的(圖2)[13]。

方框表示外顯子，直線表示內含子，不同顏色的方框分別表示部分外顯子和內含子(用i表示)。a、b、c、d、e表示可變轉錄本Boxes indicate exon, lines indicate intron, those closed boxes with different colors indicate partial of an exon or retained intron (indicated with i). a,b,c,d,e indicate the alternative transcripts圖2 家蠶mod4(mdg4)和人ZC3HAV1L-CHMP1A基因的可變反式剪接[6, 13]Fig.2 Alternative trans-splicing of silk worm mod4(mdg4) and human ZC3HAV1L-CHMP1A genes[6, 13]

2 反式剪接反應機制

I型內含子[14]、II型內含子[15]和tRNA[16]都存在TS現象，但他們都是不依賴于剪接體的TS，本文只對剪接體介導的RNA反式剪接(spliceosome-mediated RNAtrans-splicing, SMaRT)產生機制進行介紹。

2.1 反式剪接具有和順式剪接相同的反應機制

一系列研究表明，SMaRT具有和CS相同的剪接機制。首先，具有相同的剪接信號。TS不存在特殊的反式剪接位點(trans-splice sites, TSSs)。綿羊TRB基因座含有3個D-J-C(多樣區-連接區-恒定區)基因簇，該區域的TS都發生于D/J和J/C連接點，沒有形成新的SSs[8]；Ma等[17]通過高通量測序技術在豬上鑒定了251個嵌合RNAs，其中大多數分子的SSs符合GT-AG規則。

其次，具有相似的剪接體組分。U1、U2、U4/U6和U5等核內小核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins, snRNP)共同組裝成順式剪接體。早期在秀麗線蟲和蛔蟲中的研究表明，U2、U4/U6、U5等snRNPs都是SL-型TS的基本因子[18]，后來發現，錐體蟲中U1 snRNP在CS和TS中發揮著雙重作用[19]。

另外，具有類似的剪接調控因子。SR蛋白、Sm蛋白、核內不均一核糖核蛋白和多聚嘧啶序列結合蛋白等順式剪接調控因子均參與調控TS[20-23]。在目前鑒定的哺乳動物TS反應中，尚未發現特殊的剪接調控因子。

2.2 反式剪接的特點

2.2.1 形成Y-結構 不同于CS的套馬索結構，TS的中間產物是一個Y-結構。Y-結構最早是在研究錐體蟲SL-型TS中發現的[24]，全轉錄組水平上的研究進一步證明了Y-結構存在的普遍性[25]。在進行TS時，被剪接掉的區域不是一個連續的內含子，而是來自于兩個不同的基因，剪接供體位點和分支點分別位于不同的基因上，當分支點游離羥基與5′ SS通過2′-5′磷酸二酯鍵結合后，反式內含子的上游和下游之間不能形成一個閉合的套馬索結構，而是開放的Y-結構(圖3)。

圖3 反式剪接的Y結構Fig.3 Y-structure in trans-splicing

2.2.2 含有互補配對序列 CS的外顯子都位于一個基因上，彼此具有較近的物理距離。TS的反式內含子則含有互補配對序列，通過該序列形成二級結構，促進兩個獨立pre-mRNA彼此靠近，為剪接反應創造條件(圖4)。人和小鼠TS的上游內含子含有嘧啶富集區，下游內含子具有嘌呤富集區，二者幾乎能夠完全互補配對[26]。腸賈第蟲HSP90和OADβ基因都是TS產物，其中HSP90反式內含子的上、下游區域含有26 bp互補配對區，OADβ基因在配對的堿基數和序列組成上存在著一定的差別，但也能形成二級結構[27]。秀麗線蟲位于eri-6和eri-7位點之間的正向重復序列介導了這兩個獨立基因間的TS，從而形成ERI-6/7蛋白的完整編碼序列[28]。

長方形表示外顯子，直線表示內含子或外含子Rectangles indicate exon, lines indicate intron or outron圖4 互補配對結構及序列的反式剪接Fig.4 Complementary structure and its trans-splicing

3 反式剪接在哺乳動物中的作用

低等真核生物的SL-型TS是在pre-mRNA的5′端加上一個帽狀結構，不改變其原有的編碼作用，因此不影響蛋白質組的復雜性和多樣性，該種剪接主要對mRNA進行表達調控[29]，不涉及到編碼蛋白質的功能性通路。本文主要對哺乳動物TS及其嵌合體的功能進行介紹。

TS把兩個或多個不同來源的pre-RNA分子剪接成一個嵌合分子，這種來源的嵌合RNA也稱為tsRNA(trans-splicing RNA)，嵌合點的位置存在著以下幾種可能：(1)位于UTR區，導致一個親本基因的5′或者3′ UTR發生改變；(2)位于編碼區內部，但破壞了原有的讀碼框，導致移碼融合(frame-shift fusion)。大部分TS屬于該種形式[12]，所產生的嵌合子可以作為長鏈非編碼RNA發揮作用；也可能在嵌合點下游形成提前終止密碼子，從而被生物體內的監測系統——無義介導的mRNA降解機制——降解掉；(3)位于編碼區內部，并且不破壞兩個基因的讀碼框，即發生了框內融合，嵌合子編碼產生融合蛋白。因此，通過形成tsRNA，TS能夠影響親本基因表達、形成新蛋白質或非編碼RNA，在細胞活力和生長、基因表達調控、信號轉導等一系列生物過程中發揮著重要的調控作用。

3.1 反式剪接調控基因表達

人酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶1(acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1，ACAT1)基因通過TS形成的一種轉錄變異體(4.3-kb mRNA)，幾乎存在于所有組織細胞內[30]。通過起始密碼子的選擇性使用，4.3-kb mRNA翻譯產生正常的ACAT1酶(50 ku)和N-端含有額外序列的一種亞型(56 ku)，該亞型的活性是正常酶(50 ku)的30%[31]。因此，ACAT1通過產生嵌合RNA來競爭使用pre-mRNA，從而調控正常序列表達、影響酶活性。小鼠5號染色體上的非編碼RNA(Dmr)和19號染色體上的Dmrt1基因形成的嵌合子，編碼產生缺少C端的Dmrt1蛋白，Dmr主要充當嵌合子的3′ UTR，促進TS、下調正常Dmrt1蛋白表達量[32]。HongrES2是大鼠附睪組織中鑒定的嵌合、非編碼RNA，其下游基因為附睪特異表達的CES7，HongrES2具有5′ 帽子結構和3′ poly(A)尾，類似于mRNA前體，加工成熟后的產物為microRNA樣小RNA(microRNA-like small RNA)，能夠抑制CES7基因表達[33]。

3.2 反式剪接調控細胞生長和癌癥發生

Hirano和Noda[34]利用簡并PCR在精子cDNA 文庫中分離得到了減數分裂同源重組基因Msh4的7條cDNA，其中3條(Msh4β、ε和δ)是基因間TS產物，主要表達于精子中，Msh4β和ε在腦、心、胸腺和卵巢等組織中也有少量表達；進一步研究發現，Msh4δ能在精子發生過程中誘導細胞程序性死亡。嵌合分子CYCLIN D1-TROP2編碼產生截短的CYCLIN D1(細胞周期蛋白D1)和TROP2(滋養層細胞表面抗原-2)，在原代培養的細胞中異源低表達CYCLIN D1-TROP2，促進細胞增殖、延長壽命，高表達則能導致細胞轉化[35]。CHD2和CHMP1A基因分別位于人15和16號染色體上，二者編碼的蛋白質都調控染色質/DNA結構，嵌合分子CHD2-CHMP1A在多種腫瘤組織和細胞系中表達，通過RNAi技術敲低其在HBL-100細胞系中的表達后，細胞生長受到明顯抑制[36]。在腎癌和結腸癌細胞中檢測到的tsADK-DHX8能夠調控細胞生長[36]。

細胞過度生長和細胞周期改變都是癌癥的標志[37]，tsRNA與癌癥發生、發展存在著密切關系，可以作為腫瘤診斷的生物標記[38]。約90%的前列腺癌細胞都表達TMEM79-SMG5嵌合分子，在健康的對照組織中不表達[39]。嵌合分子MN1-FLI和NIPBL-HOXB9被注入到小鼠骨髓后，能夠誘發白血病[40]。CYCLIN D1-TROP2是一種強致癌因子，能促進侵襲性腫瘤生長[35]。Xie等[41]通過對多種組織和癌細胞檢測發現，除了嵌合分子PAX3-FOXO1，還有些tsRNA在橫紋肌肉瘤細胞系和臨床樣本中特異表達，并具有與PAX3-FOXO1相同的瞬時表達模式。此外，原發性大腸癌[42]、急性髓樣白血病[43]等疾病中都鑒定出了相關嵌合分子。

3.3 反式剪接介導染色體重排

TS和染色體重排存在著一定的聯系。染色體易位[t(7;17)(p15q21)]形成的嵌合分子JAZF1-JJAZ1與子宮內膜間質腫瘤具有明顯相關[44]，研究發現，在染色體組成正常非腫瘤細胞內也存在著tsJAZF1-JJAZ1[45]。tsJAZF1-JJAZ1在子宮內膜基質細胞發育中受到嚴格的表達調控，嵌合子的轉錄量明顯低于親本基因，翻譯產生的嵌合蛋白具有抗凋亡作用[45]。人、鼠上的熒光原位雜交分析發現[46]，位于15號染色體上的原癌基因Myc和12號染色體上的免疫球蛋白重鏈基因Igh共同出現在同一個轉錄工廠(transcription factory)上，具備發生TS的條件。而在漿細胞瘤和伯基特淋巴瘤患者中，這兩個位點非常頻繁地發生易位。人2號和13號染色體易位形成的嵌合分子PAX3-FOXO1，是腺泡狀橫紋肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma, ARMS)的診斷標志物和治療靶標[47]，其編碼的嵌合蛋白誘導肌肉生成、并抑制其分化產生成熟肌肉組織[48]。沒有發生易位的間充質干細胞和胎兒肌肉組織均能形成tsPAX3-FOXO1[49]。在間充質干細胞中，該嵌合分子在其他生肌因子轉錄之前瞬時表達；在胎兒肌肉組織中，其相對表達量遠低于橫紋肌肉瘤細胞系。過表達PAX3-FOXO1導致MyoD和Myogenin兩種肌肉標記物持續表達，并最終形成ARMS的肌肉發育和過表達癥狀。綜上，研究者認為，tsRNA具有重要的生理功能，是機體正常生長發育所必須的；同時可作為骨架促進染色體間相互作用，是染色體發生重排的前提條件[50]；而染色體重排造成的嵌合子表達失調是導致癌轉化的原因[45]。

3.4 反式剪接維持胚胎干細胞多能性

Wu等[51]在生物信息學分析基礎上，通過兩種逆轉錄酶(MMLV和AMV)催化的RT-PCR反應及RNase保護試驗，在人胚胎干細胞(human embryonic stem cell, hESC)中鑒定了4個tsRNA——tsCSNK1G3、tsARHGAP5、tsFAT1和tsRMST，他們均在hESC體外分化過程中差異表達。其中，tsRMST在hESC和多種體細胞(皮膚成纖維細胞、毛乳頭細胞和顆粒細胞)重編程形成的誘導性多能干細胞中高表達，但在肌肉、肝、腎等10種分化的組織中不表達。利用小發卡RNA (small hairpin RNA, shRNA)敲低tsRMST表達，hESC中多能性基因(NANOG、POU5F1、SOX2和TCF7L1)的表達受到顯著抑制，而種系特異的轉錄因子(GATA6和PAX6)表達量增加，進一步分析證明了tsRMST通過招募NANOG和PRC2復合體抑制種系特異基因表達，維持hESC多能性。

3.5 反式剪接的其他功能

G蛋白信號調節因子(regulaotrs of G-protein signaling, RGS)是G蛋白信號轉導通路中的負性調節因子，能夠與一些受體、效應分子相互作用，調節G蛋白信號通路。tsRGS12嵌合分子在組織中特異表達，其編碼產物以細胞周期依賴的方式定位于核點，與減數分裂中期的染色體形成有關，過表達該嵌合分子導致細胞內形成不規則核與多核。此外，TS改變了正常RGS12基因的表達量，形成了新蛋白質，必然會對G蛋白的信號轉導功能產生影響[52]。

對嵌合蛋白的結構分析表明，嵌合子含有完整蛋白結構域的幾率非常顯著地高于隨機序列，暗示著TS及其產物在生命活動中具有一定作用[53]。有些嵌合分子的編碼蛋白與親本蛋白互相競爭，擾亂原有的蛋白互作網絡[53-54]。隨著TS產物作用的揭示，人們逐漸認識到其在生理、病理活動中的重要性，研究范疇也在逐漸擴大，從最初的癌癥相關研究擴展到生命活動的多個領域，但Huang等[55]通過定量PCR分析發現，嵌合RNAs和衰老之間不存在相關性，這可能和樣本數及檢測的嵌合RNAs數量較少有關。

3.6 反式剪接在疾病治療中的作用

基于SMaRT的產生機制，人們開發了基因靶向療法，基本原理是設計合成靶向內源、缺陷mRNA前體的RNA分子——pre-mRNA反式剪接分子(pre-mRNA trans-splicing molecule, PTM)，其上含有與靶內含子互補的配對序列、催化剪接反應的人工內含子、以及替代缺陷序列的正確cDNA片段。PTM被注入到體內(細胞)后，首先利用互補配對序列識別、結合內源pre-mRNA，然后在剪接體介導下，內源pre-mRNA與PTM進行TS形成一個嵌合分子，在此過程中外源cDNA替代了內源pre-mRNA的缺陷序列，從而達到修復缺陷RNA的目的[56]。

脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy, SMA)是一種神經退行性疾病，是導致嬰兒期死亡的主要遺傳因素，由運動神經元存活基因1(survival motor neuron 1, SMN1)缺失導致[57-58]。人基因組中含有SMN1和SMN2兩個基因，二者具有完全相同的開放讀碼框，但SMN2的大部分轉錄本都是可變剪接產物，編碼產生的截短蛋白穩定性差、沒有功能[59]。SMN2基因存在于所有的SMA患者中，校正SMN2基因的可變剪接位點、抑制其可變剪接，是SMA分子治療的可行思路[60]。Coady和Lorson[61]把人工合成的、靶向修復SMN2的PTM注射入SMA小鼠的側腦室，在體內實現了SMN功能蛋白的挽救性表達，減輕了小鼠SMA癥狀，延長了生存期。

TS在遺傳性疾病治療方面的巨大潛力引起了人們的廣泛研究興趣，目前已經利用PTM對亨廷頓疾病[62]、營養不良大皰性表皮松懈癥[63]、肥厚性心肌病[64]、鐮狀細胞貧血病[65]、B細胞急性淋巴細胞白血病[66]、直腸癌[67]、先天性肌肉營養不良癥[68]等多種疾病的遺傳因子修復方面進行了試驗研究，并得到了預期效果。在病毒性疾病的治療方面，TS也展現了良好的應用前景。Ingemarsdotter等[69]構建了靶向人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)RNA SSs位點的TS載體，并成功地在攜帶HIV的細胞內獲得了tsRNA，實現了選擇性殺死感染細胞。以期TS介導的基因靶向療法將會實現臨床上的應用。

4 小結與展望

TS及其嵌合RNAs在一系列生理、病理活動中發揮著重要作用，在正常細胞中的表達量較低且受到嚴格的時空調控，在特定條件下或癌細胞等細胞類型中的表達失調，導致染色體易位和腫瘤發生。但當前研究多集中在利用高通量測序結合生物信息學方法鑒定癌癥相關tsRNA和試驗驗證層面，缺乏研究深度。研究的對象主要是人和小鼠，TS在農業動物領域方面的作用及應用前景有待揭示。進一步闡明哺乳動物TS在基本生命活動中的作用及產生機制，有助于深入揭示其生理/病理學意義，更好地為畜禽遺傳改良和人類遺傳性疾病的靶向治療服務。

由于表達量較低，傳統的RNA酶保護試驗、Northern blot、Western blot等可信度高的分析方法往往靈敏度不夠；而基于逆轉錄的檢測方法(如RT-PCR)又容易形成假陽性，在一定程度上阻礙了TS在非腫瘤細胞中的研究，需要對相關試驗技術進行改進和完善。近年來發展起來的直接RNA測序方法、Hi-C三維基因組研究技術、蛋白質數據分析方法為TS及其嵌合RNA研究提供了新的工具。鑒于其在生命活動中的重要性以及相關試驗方法的不斷改進、完善，TS必將會成為遺傳學研究中的一個重要內容。