組蛋白甲基化抑制劑UNC0638對水牛轉基因細胞外源基因表達的影響

劉曉華，文冬梅，余 慶，鄧 凱，陸鳳花，石德順

(廣西大學，亞熱帶資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004)

轉基因動物在定向育種、生物反應器、疾病模型、器官移植、功能基因組學等領域發揮著重要作用。如何提高轉基因動物的生產效率，定點整合外源基因及維持外源基因高豐度表達[1]是轉基因研究領域面臨的主要問題。整合有外源基因的細胞其基因表達水平會伴隨著傳代次數的增加被抑制[2-4]，表觀遺傳修飾的動態變化可能是影響基因表達的主要因素。

組蛋白修飾作為表觀遺傳中重要的調控機制之一,在包括基因表達調控等多種生物學過程中起著重要作用。哺乳動物中，組蛋白甲基轉移酶EHMT2被認為是常染色質區催化組蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)，并調節該區域基因表達的主要酶[5]。H3K9me2是基因轉錄抑制及異染色質形成的主要原因[6]，異染色質作為染色體的組成部分，在細胞周期中保持濃縮狀態，具有重要的生物學功能。克隆胚胎中異常的組蛋白H3K9me2導致多能性基因Oct4無法正常表達[7]，高豐度的組蛋白H3K9甲基化水平是阻礙細胞獲得全能性的主要因素[8]。組蛋白賴氨酸甲基轉移酶EHMT2特異性抑制劑BIX01294[9]成功應用于多能干細胞的誘導及克隆胚胎發育率的提高[10-11]，但由于較高的細胞毒性在綿羊與小鼠克隆胚胎的應用中并未獲益[12-13]。Vedadi等[14]報道的小分子抑制劑UNC0638可高效特異性的結合組蛋白H3K9me2甲基化轉移酶EHMT2與EHMT1，并具較低的細胞毒性。供體細胞經UNC0638處理后，可顯著降低克隆胚胎H3K9me2水平，并影響克隆胚胎發育關鍵基因Nanog與Oct4的表達[15]。

轉基因細胞在體外培養、胚胎發育過程及轉基因動物個體中普遍存在外源基因沉默現象[16]。UNC0638作為一種組蛋白修飾小分子藥物能否通過調節H3K9me2甲基化水平，進而促進外源基因表達，仍未見相關的報道。因此，初步探討UNC0638對轉基因細胞外源基因表達的影響，有助于人們進一步了解外源基因整合后的表達機制，并為轉基因水牛生產效率的提高提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 水牛胎兒成纖維細胞(BFFs)與以綠色熒光蛋白(eGFP)基因為報告基因的轉PRL基因水牛胎兒成纖維細胞系由廣西亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室培養保存。

1.1.2 試劑 本試驗所用試劑除特別注明外，其它試劑均來自美國Sigma公司；UNC0638購自Cayman公司，組蛋白H3K9me2甲基化抗體購自Abcam公司。胎牛血清(FBS)購自HyClone公司；無Ca2+、Mg2+的杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.25%胰酶(trypsin)，細胞培養液：DMEM+10% FBS；一抗：Anti-Histone H3 (di methyl K9) 的鼠源單克隆抗體(1∶100)；二抗：FITC標記的兔抗鼠IgG (1∶200)；UNC0638液: DMSO預溶，以DMEM液配制50 μmol·L-1母液，根據試驗要求用DMEM液稀釋成不同濃度的工作液，在工作液中，DMSO的濃度要控制在0.1%以內。

1.2 方法

1.2.1 BFFs傳代培養及生長曲線繪制 BFFs復蘇后傳代培養，分別用添加有不同濃度(0.0、0.5、1.5、2.5、5.0 μmol·L-1)UNC0638的DMEM培養液重懸，調整細胞密度約為(2～3)×104·mL-1，接種于24孔細胞培養板中，每孔500 μL，置于38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養，每3 d換液1次。每隔24 h消化細胞，每個培養濃度消化，分別收集3個孔的細胞，連續8 d，用細胞計數板計數，每孔記數3次，取其平均值進行生長曲線的繪制。

1.2.2 BFFs染色體核型分析 UNC0638處理第7代BFFs 48 h后，使用濃度為0.1～0.2 μg·mL-1秋水仙素繼續培養3 h，收集細胞。加入預熱至37 ℃的0.075 mol·L-1KCl低滲處理，加入2 mL新鮮配制且預冷的甲醇-冰乙酸(3∶1)固定液，固定細胞1～2 min，離心棄上清。加5 mL新鮮配置的甲醇-冰乙酸(3∶1)固定液，使用槍頭吹出來的氣泡輕輕吹打細胞，重懸細胞，室溫條件下固定30 min。離心棄上清后，加入200 μL固定液，輕輕吹打混勻細胞。吸取細胞懸液，在距離20 cm以上的高度滴1～2滴細胞懸液于-20 ℃預冷的載玻片上，固定細胞。用Giemsa染液染色15～20 min，清水沖洗后晾干。在顯微鏡下觀察細胞染色體數目，對典型的中期染色體拍照，隨機抽取統計染色體數目。

1.2.3 免疫熒光檢測BFFs組蛋白H3K9me2甲基化水平 BFFs分別經不同濃度(0.0、0.5、1.5、2.5、5.0 μmol·L-1)UNC0638處理48 h后，取出爬片上的細胞玻片，放入12孔板內，PBS清洗兩次后，室溫下用4%多聚甲醛固定40 min。阻斷液(含有100 mmol·L-1的甘氨酸和0.3% BSA的PBS緩沖液)沖洗3次，每次5 min，用1% Tritonx-100室溫透化25 min，阻斷液沖洗3次，每次5 min。1% BSA室溫封閉1 h，Triton-BSA-PBS洗3次后加入100 mL一抗，4 ℃過夜孵育，次日37 ℃生化培養箱孵育30 min，Triton-BSA-PBS洗3次。二抗室溫避光孵育1.5 h，Triton-BSA-PBS沖洗3次。10 μg·mL-1碘化丙啶(PI)室溫避光染核10 min，Triton-BSA-PBS沖洗3次，凡士林壓片，使用激光共聚焦掃描拍照。

1.2.4 BFFs細胞RNA提取 使用不同濃度(0.0、0.5、1.5、2.5 μmol·L-1)UNC0638處理水牛轉基因BFFs(24、48 h)后， Trizol法提取RNA，分光光度計及電泳檢測其純度和完整性，置于-80 ℃冰箱保存備用。按照一步快速反轉錄試劑盒(北京全式金生物公司)進行反轉錄反應，反轉錄體系20 μL:2 μg總RNA，5×TransScript All- in-One SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water補足20 μL，輕輕混勻后，42 ℃孵育15 min，85 ℃滅活5 min，4 ℃終止。

1.2.5 qRT-PCR檢測 qRT-PCR的反應體系為20 μL：RT-PCR產物1 μL，2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10 μL，Primer F/R (10 μmol·L- 1) 0.6 μL，RNase Free water 8.4 μL。反應條件：95 ℃變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ (或者58 ℃) 1 min，40個循環，試驗對每個樣品進行3次重復。β-actin作內參對其進行標準化，運用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量，組間差異利用SPSS軟件進行統計分析。引物信息見表1。

表1用于PCR反應各個基因引物序列和反應條件

Table1DetailsofprimersusedforPCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence退火溫度/℃Tm長度/bpLengthβ-actinF:ACCGCAAATGCTTCTAGG58199R:ATCCAACCGACTGCTGTCeGFPF:ACGGCATCAAGGTGAACT60201R:GTGTTCTGCTGGTAGTGGTC

1.3 數據分析

免疫熒光強度相對水平的分析和基因相對表達量的分析均采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)。每個試驗重復至少3次，染色體核型分析采用卡方檢驗，P>0.05表示差異不顯著；P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 不同濃度UNC0638對BFFs增殖的影響

不同濃度(0.0(對照組)、0.5、1.5、2.5、5.0 μmol·L-1)UNC0638處理BFFs 8 d。結果如圖1所示，UNC0638處理組與對照組相比，生長曲線趨勢大致相同，均呈“S”形分布。0.5、1.5、2.5 μmol·L-1處理組與對照組相比細胞增殖效率沒有顯著變化，5.0 μmol·L-1處理組細胞生長受到抑制，3 d后開始增殖，與其他各組相比細胞增殖效率下降。

2.2 不同濃度UNC0638對BFFs核型的影響

BFFs正常數目染色體如圖2 a所示，異常染色體數如圖2 b所示。結果顯示BFFs經不同濃度(0.0、0.5、1.5、2.5 μmol·L-1)UNC0638處理48 h后對其細胞核型無顯著影響(表2)。

圖1 不同UNC0638濃度對BFFs生長曲線的影響Fig.1 Growth curves of BFFs cultured in different concentration of UNC0638

a.正常染色體數(46,XX)；b. 異常染色體數a.Normal chromosome No.; b.Abnormal chromosome No.圖2 BFFs染色體中期分裂相Fig.2 The metaphase spreads of chromosome of BFFs

表2不同濃度UNC0638處理BFFs后的核型分析

Table2KaryotypeanalysisofBFFsindifferentconcentrationofUNC0638

UNC0638濃度/(μmol·L-1)Concentration of UNC0638總數(n)Total非整二倍體數(≠2n)Non-diploid No.正常率/%Normal rate0.021290.470.524387.501.520385.002.521385.71

2.3 不同濃度UNC0638對BFFs組蛋白H3K9me2甲基化狀態的影響

BFFs分別經不同濃度(0.0(對照組)、0.5、1.5、2.5、5.0 μmol·L-1)UNC0638處理48 h，檢測各組細胞組蛋白H3K9me2甲基化水平(圖3a),并統計熒光強度，結果如圖3b所示：各處理組與對照組相比組蛋白H3K9me2甲基化水平顯著降低(P<0.05)，其中0.5、1.5、2.5 μmol·L-1組間不存在顯著差異(P>0.05)，5.0 μmol·L-1組顯著低于0.5 μmol·L-1組(P<0.05)，但與1.5、2.5 μmol·L-1組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 不同濃度UNC0638對轉基因BFFs eGFP基因表達的影響

不同濃度(0.0(對照組)、0.5、1.5、2.5 μmol·L-1)UNC0638處理轉基因BFFs(24、48 h)后，結果如圖4所示：處理24 h，僅2.5 μmol·L-1處理組eGFP的表達顯著高于對照組(P<0.05)；處理48 h，各處理組與對照組相比eGFP的表達水平顯著提高(P<0.05)。

3 討 論

轉基因動物研究始于20世紀70年代末，是生物技術領域研究熱點之一，該技術具有廣闊的應用前景及重要的經濟價值。然而轉基因動物生產過程中外源基因導入仍面臨著效率低及無法精確控制基因表達等問題。有報道指出一些與轉錄激活有關的表觀遺傳小分子抑制劑可提高外源基因在體內外的表達水平[17]。本研究探討組蛋白甲基化小分子抑制劑UNC0638處理水牛轉基因BFFs后對外源基因表達效率的影響。

a.BFFs組蛋白H3K9me2的變化(200×)；b.相對熒光強度。不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。下同a.The H3K9me2 status of BFFs(200×); b.The relative fluorescence intensity of BFFs.Different small letters mean significant difference among the groups (P<0.05)，same small letters mean not significant difference among the groups (P>0.05).The same as below圖3 UNC0638處理48 h后對BFFs組蛋白H3K9me2的影響Fig.3 Effect of H3K9me2 on BFFs after 48 h UNC0638 treatment

圖4 不同濃度UNC0638對轉基因BFFs eGFP基因表達的影響Fig.4 Effect of different concentration of UNC0638 on the expression of eGFP gene in transgenic BFFs

組蛋白是染色質的核心，其尾部的乙酰化、磷酸化、甲基化等共同組成了組蛋白密碼并控制基因表達。組蛋白H3與H4賴氨酸甲基化參與多種生物學過程，包括轉錄的控制、DNA甲基化、異染色質區域形成、X染色體的失活等[18-19]，一些效應分子可特異性閱讀不同的賴氨酸甲基化密碼調節轉錄過程[20]。催化組蛋白賴氨酸甲基化的蛋白含有一個共同的結構域(SET結構域)，主要有Suv39h1、Suv39h2、EHMT2、EHMT1，其中EHMT2與EHMT1是控制常染色質區域組蛋白甲基化的主要蛋白。組蛋白修飾在重編程過程中發揮重要的作用，H3K9me2修飾與基因的轉錄調節有關[21-22]，并可調控Oct4在胚胎中的表達[23]。Chen等[8]報道，在誘導多能干細胞過程中組蛋白H3K9me2甲基化是抑制重編程的主要因素。此外，PGC7可以與含有H3K9me2的染色質結合，阻斷TET3蛋白的主動去甲基化活性，以保護受精卵中的特異性的印記基因[13]。使用H3K9me2抑制劑BIX01294處理羊克隆胚胎可以顯著降低胚胎組蛋白H3K9me2水平，但對囊胚發育率無顯著影響[24]。Park等[25]指出BIX01294的高細胞毒性可能是影響胚胎發育的主要原因，阻礙了其在細胞重編程領域的研究與應用。UNC0638是一種新型的組蛋白甲基化抑制劑[14]，具更高效的組蛋白甲基化抑制效率與細胞毒性，因而在提高體細胞克隆效率和外源基因表達上有極高的利用價值。

Vedadi等[14]報道，UNC0638處理濃度大于0.5 μmol·L-1時可顯著降低人乳腺癌細胞株的H3K9me2水平。本研究基于此設置濃度梯度，在探討UNC0638對BFFs生長特性及細胞毒性的影響時發現，BFFs經5.0 μmol·L-1濃度的UNC0638處理后細胞增殖減緩，處理48 h不影響細胞的核型正常率，結果與Vedadi等[14]報道的細胞毒性檢測試驗(MTT)結果相符，UNC0638藥物安全指標(EC50)為(EC50=(11 000±710) nmol·L-1(n=3))，BIX01294為(EC50=(2 700±76) nmol·L-1(n=3))， 說明UNC0638較低的細胞毒性，一定濃度范圍內不影響BFFs的生長特性與核型。對不同濃度UNC0638處理BFFs后，其組蛋白H3K9me2去甲基化能力分析，結果顯示，0.5 μmol·L-1UNC0638在處理BFFs 12 h，即可檢測到組蛋白H3K9me2甲基化水平的顯著降低， Fu等[26]報道使用0.1 μmol·L-1UNC0638處理牛供體細胞48 h，可檢測到H3K9me2甲基化水平的顯著降低。以上結果表明，低濃度UNC0638可顯著抑制組蛋白H3K9me2的甲基化水平。經UNC0638處理后的轉基因細胞外源基因表達分析發現，不同濃度UNC0638處理48 h，與對照組相比可顯著提高細胞eGFP的表達量，黃波[27]使用組蛋白去乙酰化抑制劑TSA處理轉基因細胞可增強eGFP基因的轉錄。該結果證實UNC0638可改變由表觀遺傳修飾導致的外源基因沉默，組蛋白H3K9me2可能是抑制轉基因細胞外源基因表達的因素之一。

張一軍[28]研究發現，山羊克隆胚胎經UNC0638處理后，H3K9me2水平顯著下降與卵胞漿內單精子注射胚胎不存在顯著差異，且克隆胚胎囊胚的Oct4和Nanog基因表達量與囊胚質量顯著提高。UNC0638是否可以提高水牛轉基因克隆胚胎發育率有待進一步的研究。

4 結 論

本研究結果表明，適宜濃度的UNC0638處理BFFs，不影響其細胞增殖與核型；UNC0638可顯著降低BFFs組蛋白H3K9me2甲基化水平，并提高水牛轉基因細胞外源基因的表達效率。