川芎嗪注射液對重型急性胰腺炎腎損傷大鼠腎功能的保護作用及機制研究

楊 丹，唐 靜，沈文擁，吳 濤，劉愛民，鄧明明

(1. 重慶市涪陵中心醫(yī)院，重慶 408000；2. 瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床上常見的急腹癥，占整個急性胰腺炎的10%～20%，具有病死率高、并發(fā)癥多和預后差等特點[1-2]。急性腎衰竭(ARF)是SAP最主要的并發(fā)癥之一，亦是導致SAP患者死亡、住院時間延長和住院費用提高的主要原因之一，其發(fā)生率為14%～43%[3-4]。目前針對SAP合并ARF尚無特效療法。中藥川芎的有效成分川芎嗪可調節(jié)細胞凋亡，清除氧自由基，調節(jié)炎癥遞質的釋放和增加臟器微循環(huán)血流量，廣泛用于各種疾病的治療[5-6]。本研究觀察了川芎嗪注射液對SAP大鼠腎細胞的保護作用，旨在為SAP合并ARF的臨床治療提供更多參考依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物 45只健康雌性SD大鼠，體質量200～250 g，由陸軍醫(yī)科大學附屬大坪醫(yī)院動物實驗中心提供，標準顆?；旌巷暳衔桂B(yǎng)。

1.2試劑及儀器 0.6%川芎嗪注射液(無錫第七制藥廠)，兔抗大鼠β-actin多克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體和Bax多克隆抗體(SantaCruz公司)，DAB顯色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，原位細胞凋亡(TUNEL)試劑盒(美國Roche公司)。光學顯微鏡(BX60，日本Olympus公司)，全光譜分光光度儀(VARIOSKAN10-240VAC，德國Eppendorf公司)，離心機(5415D，德國Eppendorf公司)，全自動生化分析儀(Hitachi 7060，日本Olympus公司)， 超低溫冰箱 (8571型 ，美國Forma儀器公司)，光學攝像系統(tǒng)(AX-70，日本Olympus公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYH-DHS-50X65-B-Ⅱ，上海躍進醫(yī)療器械廠)，微量加樣槍( Eppendorf，德國Eppendorf公司)

1.3實驗方法 將45只雌性SD大鼠隨機分為正常組、模型組和川芎嗪組，每組15只。模型組和川芎嗪組以4%牛磺膽酸鈉經腹腔逆行胰膽管注射方法制備SAP模型，空白組大鼠開腹后翻動腸壁即關腹。術后10 min正常組、模型組大鼠尾靜脈注射生理鹽水10 mL/kg，川芎嗪組大鼠尾靜脈注射0.6%川芎嗪注射液10 mL/kg。

1.4觀察指標

1.4.1血清淀粉酶(AMY)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平 分別于術后12 h、24 h和48 h，每組隨機選取5只SD大鼠各抽取股動脈血5 mL，置于生化管中，用于檢測血清AMY、BUN和Cr水平。

1.4.2腎組織HE染色病理表現(xiàn) 分別于術后12 h、24 h和48 h，每組隨機抽取5只SD大鼠處死，留取約1.0 cm3腎實質組織并置于4%甲醛中固定，脫水，常規(guī)石蠟切片包埋，進行HE染色，光鏡下觀察腎組織的病理形態(tài)學。采用Rabb法[2]評估腎臟組織損傷情況，其中單種改變病理損傷范圍>75%記為4分，單種改變病理損傷范圍>25%～75%記為3分，單種改變病理損傷范圍5%～25%記為2分，單種改變病理損傷范圍<5%記為1分，無病理損傷記為0分。常見病理變化包括腎小管上皮細胞水腫、壞死、脫落，腎間質炎癥及水腫，基底膜斷裂再生，腎小球皺縮，腎小囊擴張，近曲小管的刷狀緣丟失等。

1.4.3腎組織細胞凋亡指數(shù) 取1.4.2項下腎組織進行免疫組織化學染色，參照文獻[1]及試劑盒說明操作。采用TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡情況，以細胞內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，統(tǒng)計腎臟標本內陽性細胞數(shù)及顯色度，陽性強度用半定量法：陽性細胞>75%記為3分，陽性細胞51%～75%記為2分，陽性細胞10%～50%記為1分，陽性細胞<10%記為0分；細胞著棕褐色為3分，著黃色為2分，著淺黃色為1分，不著色為0分。兩者積分乘積>4分為中強度陽性()，1～4分為弱陽性(+)，0分為陰性(-)。

1.4.4腎組織中Bcl-2及Bax蛋白表達情況 采用Western Blot法檢測。取3塊大小約1.0 cm3腎實質組織冷凍于-196 ℃液氮灌內，逐步解凍后，剪碎組織并勻漿，加入Western裂解液提取蛋白，4 ℃ 12 000 r/min離心取上清液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品，在10%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，100 V電轉印到PVDF膜上。后加入50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，再稀釋一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗滌膜3次，將辣根過氧化物酶標記的二抗1∶2 000稀釋后加入孵育，洗膜后ECL法顯色劑顯色并照相。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，GAPDH為參比。

2 結 果

2.13組大鼠血清AMY、BUN及Cr水平比較 正常組大鼠各時間血清AMY、BUN及Cr水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組和川芎嗪組大鼠各時間血清AMY、BUN、Cr水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，且隨著時間延長，模型組和川芎嗪組大鼠血清AMY、BUN、Cr水平均顯著提高(P均<0.05)，但川芎嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1～3。

表1 3組大鼠術后不同時間點血清AMY水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠腎臟實質組織HE染色病理表現(xiàn) 正常組大鼠術后各時間點腎臟組織未見異常，見圖1。模型組大鼠術后12 h HE染色顯示腎小管上皮細胞中重度腫脹，腎小球毛細血管淤血；術后24 h顯示腎小管上皮細胞腫脹，少量壞死，細胞界限不清，炎細胞浸潤，可見間質水腫，腎小球毛細血管淤血；術后48 h顯示腎小管上皮細胞腫脹，明顯壞死，大量炎癥細胞浸潤，間質明顯水腫，腎小球毛細血管明顯淤血，見圖2。川芎嗪組大鼠術后各時間點腎小管上皮細胞腫脹程度、細胞壞死數(shù)量、炎細胞浸潤及間質水腫程度均較模型組輕，見圖3。模型組和川芎嗪組大鼠腎臟組織損傷病理評分顯著高于正常組(P均<0.05)，但川芎嗪組顯著低于模型組(P均<0.05)，見表4。

表2 3組大鼠術后不同時間點血清BUN水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表3 3組大鼠術后不同時間點血清Cr水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.33組大鼠腎組織細胞凋亡指數(shù)比較 凋亡細胞主要位于腎小管上皮細胞，胞質和胞核染成棕褐色，腎間質和腎小球凋亡細胞較少。正常組大鼠術后各時間點凋亡指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組和川芎嗪組大鼠各時間點凋亡指數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)，且隨著時間延長，模型組和川芎嗪組大鼠凋亡指數(shù)均顯著提高(P均<0.05)，但川芎嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表5。

圖1 正常組大鼠術后不同時間點腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 模型組大鼠術后不同時間點腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖3 川芎嗪組大鼠術后不同時間點腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

組別12h24h48h正常組49.98±0.920.47±0.610.42±0.39模型組56.42±0.63①8.019±1.22①7.982±1.66①川芎嗪組54.12±1.01①②4.986±0.72①②6.023±0.72①②

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表5 3組大鼠腎組織細胞凋亡指數(shù)比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.43組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較 正常組大鼠各時間腎組織中Bcl-2、Bax蛋

白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組和川芎嗪組大鼠各時間Bax蛋白表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平均明顯低于正常組(P均<0.05)，且隨著時間延長，模型組和川芎嗪組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達水平變化越顯著(P均<0.05)，但川芎嗪組Bax蛋白表達水平均明顯低于模型組而Bcl-2蛋白表達水平均明顯高于模型組(P均<0.05)。見圖4和表6。

1和2為正常組；3～5為模型組；6～8為川芎嗪組圖4 3組大鼠腎組織中 Bcl-2、Bax 蛋白表達情況

組別Bax12h24h48hBcl-212h24h48h正常組1.008±0.0151.006±0.0181.009±0.0060.816±0.0060.819±0.0040.818±0.002模型組1.020±0.021①1.028±0.028①1.043±0.010①0.593±0.004①0.627±0.009①0.695±0.017①川芎嗪組1.015±0.028①②1.019±0.025①②1.028±0.020①②0.722±0.008①②0.731±0.013①②0.774±0.011①②

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

川芎嗪是從中藥川芎中分離的一種生物堿，其可改善微循環(huán)和凝血障礙，增大毛細血管口徑，促使血流增快及血流增加，促進開放毛細血管數(shù)增多并抑制白細胞游走；可降低感染性壞死性SAP患者炎癥遞質如白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，減輕炎癥反應對組織的損害；可減輕大鼠實驗性腎小球腎炎基底膜損傷，減少滲出，阻抑新月體形成，減少蛋白尿，改善腎功能；還能促進糖尿病腎病受損內皮細胞功能修復，進而延緩糖尿病腎病進展7-10。本實驗結果顯示，模型組和川芎嗪組大鼠術后各時間血清AMY、BUN、Cr水平均明顯高于正常組，但川芎嗪組均明顯低于模型組；HE染色結果顯示，川芎嗪組大鼠術后不同時間點腎小管上皮細胞腫脹程度、細胞壞死數(shù)量、炎細胞浸潤及間質水腫程度均明顯輕于模型組，病理評分明顯低于模型組，提示川芎嗪具有保護SAP致腎損傷大鼠腎臟功能作用。

既往關于SAP大鼠腎損傷的研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠的腎臟組織細胞凋亡增加，RT-PCR檢測表現(xiàn)為促凋亡基因Bax上調及抑凋亡基因Bcl-2下調，提示Bax和Bcl-2可能參與SAP的腎臟損害過程[11-13]。本實驗結果顯示，模型組大鼠腎臟組織的細胞凋亡指數(shù)、Bax蛋白表達水平均明顯高于正常組，Bcl-2蛋白表達水平明顯低于正常組，提示SAP腎損傷與Bcl-2和Bax蛋白異常表達相關，與上述研究結果一致；川芎嗪組大鼠術后不同時間點腎臟細胞凋亡指數(shù)、Bax蛋白表達水平明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達水平明顯高于模型組，表明川芎嗪可以抑制或減少SAP大鼠腎小管上皮細胞凋亡，發(fā)揮腎臟保護作用，可能機制在于上調Bcl-2蛋白表達和相對下調Bax蛋白表達。胡旭光等[14]研究顯示，川芎嗪能夠通過上調抗凋亡因子Bcl-2表達，下調軟骨細胞促凋亡因子Bax以及Caspase-3表達而抑制軟骨細胞的凋亡。李中華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可通過促進Bcl-2抑制Bax表達延緩失神經骨骼肌萎縮。韓嬌艷等[16]實驗發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可通過調節(jié)Bcl-2及Bax表達影響前列腺癌PC3細胞增殖及凋亡。宣柳等[17]報道，川芎嗪可通過調控Bcl-2和Bax蛋白抑制AA大鼠滑膜細胞的異常增殖，誘使滑膜細胞凋亡。從上述研究可見，川芎嗪調節(jié)Bcl-2及Bax表達并不具有組織特異性，這也可能是川芎嗪具有廣泛藥理作用的原因之一。

綜上所述，川芎嗪對SAP所致的腎損傷具有保護作用，其可能機制為促進Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，抑制腎小管上皮細胞凋亡，這為川芎嗪臨床用于SAP 的治療提供了一定理論依據(jù)。