外周血Th22/Treg細(xì)胞在多發(fā)性硬化患者中的水平及與嚴(yán)重程度的關(guān)系

甄 瑾 馬翔凌 田曉艷 丁海濤 傅永旺 李 攀

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

多發(fā)性硬化(MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病，神經(jīng)中樞斑片狀的炎性浸潤及脫髓鞘是MS的主要病理表現(xiàn)〔1〕。MS病灶播散廣泛且臨床癥狀較為復(fù)雜多變，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前普遍認(rèn)為T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在MS的發(fā)病過程中有重要作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，Th1細(xì)胞及巨噬細(xì)胞是引起白質(zhì)脫髓鞘的主要原因〔2〕，然而近年來不斷有研究表明，Th22細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及自然殺傷(NK)細(xì)胞等具有免疫調(diào)控功能的細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子均在MS的發(fā)生過程中起重要作用〔3,4〕。本研究著重對(duì)MS患者的Th22、Treg細(xì)胞進(jìn)行分析，并對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-22、IL-35進(jìn)行檢測(cè)，旨在研究Th22/Treg細(xì)胞在MS發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2016年2月在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院就診的復(fù)發(fā)緩解型MS(RR-MS)急性期患者39例為MS組，男14例，女25例，年齡25～61歲，平均(48.34±5.28)歲，病程0.8～12.0年，平均(5.56±3.20)年；健康體檢者35例作為對(duì)照組，男14例，女21例，年齡27～60歲，平均(47.16±4.87)歲。兩組研究對(duì)象的年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

MS組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2010年MacDonald標(biāo)準(zhǔn)中的RR-MS型診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕；②入院前3個(gè)月內(nèi)未使用免疫調(diào)節(jié)劑或糖皮質(zhì)激素；③出現(xiàn)不同程度神經(jīng)系統(tǒng)陽性癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有其他免疫性疾病者；②有腦梗死或腦出血等腦部或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病；③發(fā)生嚴(yán)重感染，有重度炎癥；④高血壓、糖尿病及肝功能異常患者。對(duì)照組均無免疫類疾病史。

本研究課題已獲倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組對(duì)象簽署知情同意書。

1.2外周血中Th22和Treg細(xì)胞檢測(cè) (1)樣品采集：空腹抽取所有研究對(duì)象的外周靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用Ficoll分層密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。(2)Th22細(xì)胞檢測(cè)：在調(diào)整后的細(xì)胞懸液中加入佛波酯(PMA)、莫能霉素及離子霉素于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入PETC-CD4抗體，4℃避光放置，孵育30 min；固定破膜后加入PE-IL-22抗體，4℃繼續(xù)避光孵育30 min，采用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果采用FACS Diva7.0軟件進(jìn)行處理，以Th22細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞的比例表示Th22細(xì)胞水平。(3)Treg細(xì)胞檢測(cè)：取已調(diào)整濃度的外周血，加入PETC-CD4抗體和APC-CD25抗體，4℃避光孵育30 min；固定破膜后加入轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白(Foxp)3封閉劑封閉5 min；加入PE-Foxp3抗體，4℃繼續(xù)避光孵育2 h，檢測(cè)方法同Th22細(xì)胞。

1.3血漿中IL-22和IL-35的測(cè)定 空腹采集靜脈血5 ml，采用肝素抗凝，3 000 r/min離心15 min，收集血清于無菌0.5 ml EP管中，-20℃保存待檢。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清IL-22和IL-35表達(dá)水平。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4MS患者病情評(píng)估 根據(jù)Kurtzke的EDSS評(píng)估量表〔6〕，從運(yùn)動(dòng)、感覺、認(rèn)知、言語、自主神經(jīng)及心理與神經(jīng)功能等方面對(duì)患者的病情進(jìn)行評(píng)估，分值從正常的0分到嚴(yán)重缺損的9分不等。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Spearman非參數(shù)檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血中Th22、Treg細(xì)胞的比較 與對(duì)照組相比，MS組外周血中Th22細(xì)胞所占比例升高，Treg細(xì)胞所占比例下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血中Th22、Treg細(xì)胞百分比比較

2.2兩組血漿中IL-22和IL-35的表達(dá)水平比較 MS組IL-22的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，IL-35水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 兩組血漿中IL-22和IL-35的表達(dá)水平比較

2.3Th22細(xì)胞和Treg細(xì)胞與MS患者病情的關(guān)系 MS組EDSS評(píng)分為0.0～8.5分，平均(3.09±0.87)分。隨著EDSS評(píng)分升高，MS傷殘程度逐漸嚴(yán)重，外周血中Th22細(xì)胞所占比例不斷增加，Treg細(xì)胞所占比例不斷減少，且兩種細(xì)胞在不同EDSS評(píng)分的組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。MS患者外周血中Th22細(xì)胞與Treg細(xì)胞所占百分比無明顯相關(guān)性(r=-0.222,P=0.445)。

表3 不同程度MS患者外周血中Th22和Treg細(xì)胞比例分布

3 討 論

MS發(fā)生原因主要是自身免疫系統(tǒng)攻擊神經(jīng)中樞，引起神經(jīng)軸突的髓鞘蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，造成脫髓鞘，甚至神經(jīng)元和軸索遭到破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)受阻進(jìn)而造成殘疾。MS是一種炎性疾病，因此，介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)及炎性因子分泌的淋巴細(xì)胞成為MS發(fā)生發(fā)展的主要研究對(duì)象。在MS發(fā)病機(jī)制研究中，早期認(rèn)為Th1細(xì)胞是MS的主要致病淋巴細(xì)胞，其在炎癥部位高表達(dá)，由Th1細(xì)胞分泌的干擾素(IFN)-γ、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等促使炎癥反應(yīng)加重，導(dǎo)致組織損傷加重〔7〕。然而，隨著Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，改變了有關(guān)MS發(fā)病機(jī)制的傳統(tǒng)觀念，不斷有研究顯示不僅Th1/Th2細(xì)胞在MS中發(fā)揮作用，Th17、Th22、Treg及記憶T細(xì)胞等均有與MS相關(guān)性的報(bào)道〔8〕。

Th22細(xì)胞是由Schmidt等發(fā)現(xiàn)的以IL-22為主要標(biāo)志因子，獨(dú)立于Th1、Th2及Th17的CD4+T細(xì)胞亞群。Th22細(xì)胞是一種穩(wěn)定的淋巴細(xì)胞亞群，不易向其他亞群分化，主要分泌IL-22、TNF-α及IL-10，其中機(jī)體內(nèi)的IL-22有37%～63%由Th22細(xì)胞分泌〔9〕。IL-22屬于IL-10家族的一員，主要依靠IL-10R2及IL-22R1發(fā)揮作用，在體內(nèi)能夠激活酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的三條細(xì)胞信號(hào)通路。有關(guān)Th22細(xì)胞在免疫性疾病中的調(diào)控機(jī)制尚不完全明確，但有研究表明在不同程度的疾病中Th22細(xì)胞的比例及IL-22的表達(dá)量均不相同。劉立民等〔10〕研究指出在原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者外周血中，Th22細(xì)胞的比例顯著高于正常組，經(jīng)藥物治療后細(xì)胞比例有所下降，說明Th22細(xì)胞在免疫性疾病中發(fā)揮免疫促進(jìn)作用，加重疾病進(jìn)程。Perriard等〔11〕表明，不同MS分型患者腦脊液及血液中IL-22和受體結(jié)合蛋白的核酸及蛋白水平均高于正常組，且IL-22可以提高星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)中含量最多的膠質(zhì)細(xì)胞，有研究顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞在MS中的活化或增生會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生神經(jīng)損傷因子，加速M(fèi)S的發(fā)生發(fā)展〔12〕。本文與上述觀點(diǎn)一致，再次說明Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-22與MS密切相關(guān)。

Treg細(xì)胞是體內(nèi)具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，表型為CD4+CD5+，研究表明只有CD4+CD5high具有免疫調(diào)節(jié)功能，而CD4+CD5int作為活化的效應(yīng)T系統(tǒng)無免疫抑制活性，因此Treg細(xì)胞在體內(nèi)的抑制水平與細(xì)胞數(shù)量及抑制活性有關(guān)。翁益云等〔13〕在MS患者外周血CD4+CD5+T細(xì)胞檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，其數(shù)量與正常組無顯著差異，但在活動(dòng)期效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，且Foxp3 mRNA表達(dá)顯著降低。FOXP3是特異性表達(dá)于Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，在Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制活性中起重要作用，多數(shù)研究證實(shí)其在免疫性疾病中表達(dá)降低〔14〕。IL-35是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)由Treg細(xì)胞分泌且具有限制機(jī)體過度免疫應(yīng)答作用的細(xì)胞因子，能夠上調(diào)IFN-γ，進(jìn)而抑制TGF-β誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞的分化。有研究表明，MS組腦脊液中IL-35水平顯著高于非炎性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者，且MS復(fù)發(fā)期IL-35的表達(dá)明顯低于緩解期，具有反饋性抗炎作用〔15〕。結(jié)合本研究結(jié)果，說明機(jī)體Treg細(xì)胞和IL-35下降，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體相關(guān)免疫抑制活性下降，可能是MS發(fā)生的原因之一。

綜上所述，患者外周血中Th22細(xì)胞百分比升高和Treg細(xì)胞百分比下降，引起胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平改變，使得機(jī)體免疫應(yīng)答增強(qiáng)，免疫抑制功能減弱，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤、髓鞘破壞可能是導(dǎo)致MS發(fā)生發(fā)展的主要原因。針對(duì)以上發(fā)病機(jī)制，可以在臨床研究中以此作為靶點(diǎn)，采取不同的措施，干預(yù)機(jī)體免疫應(yīng)答，以期緩解病情，為MS的治療提供重要的臨床依據(jù)。