肺抑瘤膏對EGFR野生型Lewis肺癌小鼠腫瘤生長及VEGF表達(dá)的影響

彭召云 鄭 心 孟憲志 李新昌 魯興隆 李龍祥

(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250001)

原發(fā)性支氣管肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其中，肺腺癌約占肺癌發(fā)病率的25%〔1〕，確診時絕大多數(shù)已屬中晚期，且化療耐藥、放療抵抗、分子靶向治療耐藥等問題的存在〔2,3〕，應(yīng)用單一治療方法難以獲得滿意療效，表皮生長因子受體(EGFR)非基因突變型肺腺癌靶向治療效果差〔4〕，因此，積極尋找有效的抗EGFR非基因突變型肺腺癌的新方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察肺抑瘤膏干預(yù)EGFR非基因突變型小鼠肺腺癌移植瘤模型，探討抑制EGFR非基因突變型肺腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6近交系雄性小鼠(動物合格證號SCXK(京)2009-0004)，6～8周齡，體重(18±2)g。接種了Lewis鼠源肺腺癌細(xì)胞株的小鼠購于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。于SPF級動物房自由飲水?dāng)z食飼養(yǎng)，溫度20～24℃，相對濕度50%～60%。通風(fēng)良好條件下，常規(guī)飼養(yǎng)至適應(yīng)環(huán)境后，進(jìn)行造模。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥物 Taq DNA聚合酶、DNA分子量Marker(寶生物公司產(chǎn)品)，測序試劑：ABI BigDye3.1。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE電泳液、預(yù)染Marker、內(nèi)參、內(nèi)參二抗、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、聚偏氟乙烯(PVDF)膜等(碧云天)。0.9%氯化鈉注射液(中國大冢制藥有限公司)，肺抑瘤膏(每毫升膏方含生藥量約4.3 g)由山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供。

1.3造模方法 頸椎脫臼法處死腫瘤生長良好的Lewis肺腺癌荷瘤小鼠，在超凈工作臺上用無菌剪刀、鑷子完整剝離腫瘤組織，于冰上研磨并制備細(xì)胞懸濁液，離心計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×107/ml，在小鼠腋窩下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2 ml/只(約含瘤細(xì)胞2.0×106個)。

1.4分組及給藥 接種腫瘤細(xì)胞后，每日觀察小鼠腋下移植瘤生長情況，當(dāng)能用游標(biāo)卡尺測到瘤體時，按照SPSS統(tǒng)計(jì)軟件隨機(jī)設(shè)立生理鹽水對照組、肺抑瘤膏干預(yù)組，每組10只。分組后開始灌胃。對照組每天予生理鹽水灌胃0.2 ml/次。干預(yù)組每天予肺抑瘤膏灌胃0.2 ml/次(相當(dāng)于70 kg成人按體表面積折算的等效劑量)。

1.5EGFR基因測序 引物序列：fw-18：TCAGGTCTGCTCCCTTCTTC，rs-18：CAGCTACATTCCCAGTCTAC GT。fw-19：TTGGATTTGTAATGTAGAGCCC，rs-19：AACTAAGGAAGCAAGATTGACC。fw-20：AGTCTTGCA TAACCTGACACTTG，rs-20：TCATCCTTGCTGCTTTTC TT。fw-21：AGGATGCCCAGATGGTTCA，rs-21：GCTGGTCTTTTGAGGGGTG。PCR 擴(kuò)增:① PCR 反應(yīng)體系(50 μl)：10×PCR緩沖液5 μl，dNTP(10 μmol/L)1 μl，primer-fw(10 μmol/L)2 μl，primer-rs(10 μmol/L)2 μl，Template 2 μl，二甲基亞砜(DMSO)1.5 μl，ddH2O 37.5 μl。②PCR 反應(yīng)條件:95℃ 5 min 1個循環(huán)，95℃ 30 s 35個循環(huán)，50℃ 30 s 35個循環(huán)，72℃ 30 s 35個循環(huán)，72℃ 10 min 1個循環(huán)。

1.6觀察指標(biāo)及方法 (1)瘤體體積：剝離瘤體后用精度為0.01 mm游標(biāo)卡尺測量瘤體最長徑、最短徑，計(jì)算瘤體體積。瘤體體積(mm3)=π×最長徑×最短徑2/6。(2)瘤重、抑瘤率及移植瘤生長指數(shù)：末次灌胃24 h后稱重處死存活小鼠，剝離瘤體，稱瘤重，計(jì)算各組腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重-干預(yù)組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。移植瘤生長指數(shù)=移植瘤重量/去除腫瘤后的小鼠體重。(3)VEGF檢測：免疫印跡法檢測移植瘤中VEGF蛋白表達(dá)以及β-actin灰度比值比較。(4)EGFR檢測：小鼠移植瘤EGFR基因(18、19、20、21 號外顯子)毛細(xì)管電泳測序。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 隨移植瘤的生長，兩組小鼠活動均減少，攻擊性降低，精神萎靡，進(jìn)食、飲水減少，毛發(fā)無光澤易脫落，對照組表現(xiàn)較干預(yù)組明顯。

2.2種植成功率 接種Lewis細(xì)胞后1 w內(nèi)所有小鼠腋下可觸及移植瘤，瘤體體積均可達(dá)100～150 mm3，成瘤率100%。

2.3瘤體體積 小鼠移植瘤種植第10天后，腫瘤體積迅速增長，可見明顯“拐點(diǎn)”。兩組小鼠可明顯看出肺抑瘤膏干預(yù)后，小鼠移植瘤體積增長明顯減緩，最后一次瘤體體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)，見圖1。

圖1 瘤體體積增長曲線

2.4兩組瘤重、抑瘤率、移植瘤生長指數(shù)比較 干預(yù)組瘤重、生長指數(shù)明顯低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組移植瘤瘤重、抑瘤率、生長指數(shù)比較

與對照組比較：1)P=0.00，2)P=0.013

2.5VEGF檢測結(jié)果 干預(yù)組移植瘤VEGF表達(dá)(0.055 5±0.012 1)低于對照組(0.110 1±0.015 6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，見圖2。

圖2 VEGF蛋白的Western印跡結(jié)果

2.6EGFR基因毛細(xì)管電泳測序結(jié)果 18、19、20、21 號外顯子均測序合格。其中20 號外顯子含polyA和polyG結(jié)果，已經(jīng)進(jìn)行加測反應(yīng)；比對結(jié)果顯示無明顯突變，見圖3、4。

圖3 樣品基因組DNA電泳圖

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3 討 論

肺癌居全球癌癥首位〔5〕，且發(fā)病率和死亡率還在不斷增長〔6〕。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于肺癌缺乏有效的治療方法，放化療有諸多的不良反應(yīng)及局限性，EGFR非基因突變型肺腺癌靶向治療效果不佳。目前臨床迫切需要安全、有效的綜合治療方案。近年來臨床研究表明中醫(yī)藥在提高肺癌患者生活質(zhì)量、顯著緩解病痛、延長生存期限、穩(wěn)定腫瘤病灶等方面有著不可替換的優(yōu)勢〔7～9〕。在腫瘤防治方面的應(yīng)用日趨被接受并得到重視，中藥抗EGFR非基因突變型肺腺癌的研究有重要臨床意義。

中醫(yī)膏方中以黨參、黃芪為君補(bǔ)益肺脾之氣；白術(shù)祛濕助脾氣健運(yùn)、茯苓滲濕健脾、麥冬養(yǎng)陰生津潤肺清心、女貞子滋補(bǔ)肝腎共為臣藥。佐以浙貝、夏枯草、山慈菇清熱散結(jié)，薏苡仁滲濕健脾，貫眾清熱涼血，莪術(shù)破血行氣、消積止痛，蜂房攻毒破積。生甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥為使。本方諸藥合用，組方嚴(yán)謹(jǐn)，扶正而不斂邪，祛邪而不傷正，氣血同治，寒熱平調(diào)，平補(bǔ)陰陽，無耗氣傷陰之弊。整體體現(xiàn)了扶正祛邪、動靜結(jié)合、攻補(bǔ)兼施的配伍特點(diǎn)。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者應(yīng)用肺抑瘤膏，可有效控制原發(fā)腫瘤病灶，減輕化療引起的毒副反應(yīng)，提高患者的生存質(zhì)量，延長患者生存期〔8～11〕。且膏劑有口感好、劑型小、服用量少、便于攜帶、易于耐受等優(yōu)點(diǎn)，充分體現(xiàn)了中藥簡、便、廉、驗(yàn)的特點(diǎn)。前期動物實(shí)驗(yàn)從抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、提高機(jī)體免疫功能等多環(huán)節(jié)入手進(jìn)行了一系列研究〔8～13〕，但對EGFR非基因突變型肺腺癌的實(shí)驗(yàn)研究尚屬首次。

本實(shí)驗(yàn)通過EGFR基因測序，證實(shí)Lewis肺腺癌EGFR基因?yàn)榉腔蛲蛔冃汀１緦?shí)驗(yàn)結(jié)果提示肺抑瘤膏對EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤原發(fā)病灶有明顯的抑制作用，能有效抑制其瘤體生長，降低移植瘤的生長率，且能降低VEGF表達(dá)。研究表明〔7〕VEGF有強(qiáng)烈加速血管上皮細(xì)胞的分化作用，從而誘導(dǎo)新血管生成，腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移部位的生長與血管新生密切相關(guān)。降低VEGF的表達(dá)可減少腫瘤新生血管的增生，最終抑制腫瘤的進(jìn)展。故推斷肺抑瘤膏治療EGFR非基因突變型肺腺癌是通過抑制VEGF的表達(dá)從而起到抑制腫瘤的目的。為尋找新的抗EGFR非基因突變型肺腺癌藥物提供了思路。