還原型谷胱甘肽抑制高同型半胱氨酸致兔動脈粥樣硬化

袁吉祥 姚成立 李繼東

(寧夏回族自治區人民醫院 西北民族大學第一附屬醫院，寧夏 銀川 750002)

流行病學研究已經確立高同型半胱氨酸血癥(HH)是動脈粥樣硬化性和血栓性心腦血管疾病獨立的危險因素〔1〕。隨機臨床試驗顯示口服補充葉酸、維生素B6、B12可以雖然可以顯著降低HH，但是似乎并沒有改善心腦血管疾病的二級預防結局〔2〕。內源性抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)成為目前防治HH所致動脈粥樣硬化研究的熱點〔3〕。本研究利用3個危險因素造成動脈粥樣硬化，分別是：動脈內膜機械損傷、高脂血癥及HH。同時利用葉酸和GSH進行干預，觀察藥物對血脂、同型半胱氨酸(HCY)、氧化應激反應及動脈粥樣硬化程度的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物和材料 健康雄性新西蘭大耳白兔40只，體重2.0～2.5 kg，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。L-蛋氨酸，膽固醇，GSH由Sigma公司提供。

1.2血管損傷模型的建立 分離右側股動脈，直視下穿刺并置入5F鞘管，經導絲引入后擴張球囊(3.5 mm×15 mm)，以12 atm的壓力擴張并拉傷腹主動脈建立血管損傷模型〔4〕。

1.3動物分組與給藥方法 健康雄性新西蘭大耳白兔40只隨機分為4組：對照組，模型組，葉酸組，GSH組。所有兔子先行腹主動脈球囊損傷術，術后對照組給予家兔顆粒飼料喂養12 w，模型組，葉酸組，GSH組術后給予5%脂肪+2%蛋氨酸顆粒飼料喂養12 w。葉酸組給予葉酸顆粒5 mg每日3次口服干預。GSH組給予GSH顆粒 0.2 g每日3次口服干預。

1.4血清檢測 術后2 w、12 w自兔子心臟采血，利用全自動生化儀檢測血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及HCY水平，采用Fenton比色法測定血清中活性氧(ROS)水平。黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)水平。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)水平(試劑盒購于南京建成生物工程研究所) 。

1.5病理學檢查 術后12 w用注射空氣法處死兔子，開腹暴露腹主動脈，剝離損傷的血管段，生理鹽水沖洗后,截取2 cm損傷血管固定于10%甲醛溶液中行血管內膜油紅O染色。截取2 cm損傷血管放入1.5 ml離心管里，-20℃冷藏，1 w內行冰凍切片油紅O染色。截取2 cm固定于10%甲醛溶液，24 h后常規石蠟包埋，間隔相同距離于血管段25%、50%、75%分位切片3次(切片厚度4 μm)，行HE染色、核因子(NF)-κB免疫組化染色后光鏡下觀察。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1術后2 w和12 w時各組血清HCY水平 術后2 w后，模型組、葉酸組及GSH組HCY水平較對照組明顯升高(P<0.05)，術后12 w后，模型組、葉酸組及GSH組HCY顯著升高(P<0.05)，對照組無明顯變化(P>0.05)。但是葉酸組、GSH組與模型組比較HCY水平均相對較低(P<0.05)，葉酸組與GSH組比較HCY相對較低，但無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 2 w和12 w時血清HCY水平

與對照組比較：1)P<0.05；與本組2 w比較：2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05，下表同

2.2術后12 w時各組血脂水平 喂養12 w后，模型組、葉酸組及GSH組血脂水平較對照組顯著升高(P<0.05)。葉酸組與模型組比較血脂水平無明顯差異(P>0.05)，GSH組與模型組比較TG,TG,LDL-C明顯降低，HDL-C明顯升高(P<0.05)，見表2。

2.3術后12 w兔子氧化應激水平 術后12 w模型組、葉酸組及GSH組氧化應激水平較對照組顯著升高(P<0.05)。葉酸組與模型組比較ROS、SOD、ox-LDL水平無顯著差異(P>0.05)，GSH組與模型組比較ROS、ox-LDL水平明顯降低(P<0.05)，SOD水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 12 w時各組血清ROS,SOD,ox-LDL水平

2.4兔腹主動脈內膜粥樣硬化斑塊形成情況 對照組兔腹主動脈新生內膜輕度增生；模型組兔子主動脈新生內膜顯著增厚，結構疏松，可見脂肪沉積形成的空泡；葉酸組兔腹主動脈新生內膜顯著增厚，可見脂肪裂隙；GSH組兔腹主動脈內膜增厚。見圖1。對照組兔腹主動脈內膜表面增生硬化，油紅O不著色；模型組兔腹主動脈內膜可見彌漫性、融合成片的鮮紅色脂質斑塊隆起凸出于表面；葉酸組兔腹主動脈內膜亦可見成片的脂質斑塊；GSH組兔子主動脈內膜表面硬化不平，可見隆起于表面的條紋狀紅色斑塊。葉酸組兔腹主動脈新生內膜脂質斑塊百分比與模型組比較未見明顯減少(P>0.05)，GSH組與模型組比較顯著減少(P<0.05)，見表4。葉酸組兔腹主動脈新生內膜厚度百分比與模型組比較未見明顯減少(P>0.05)，GSH組與模型組比較顯著減少(P<0.05)，見表4。對照組兔腹主動脈橫切面細胞增生，全層無油紅O著色；模型組兔腹主動脈管壁增厚，管壁結構疏松，各層都有鮮紅色米粥樣脂滴浸潤；葉酸組兔腹主動脈管壁增厚，結構疏松，各層都有脂滴浸潤。GSH組兔子腹主動脈管壁增厚，可見泡沫細胞，細胞內可見細小密集的紅色脂肪顆粒。見圖2。葉酸組兔腹主動脈橫切面脂質斑塊百分比與模型組比較未見明顯減少(P>0.05)，GSH組與模型組比較顯著減少(P<0.05)。見表4。對照組新生內膜NF-κB少量表達；模型組新生內膜NF-κB大量表達；葉酸組新生內膜NF-κB中量表達；GSH組新生內膜NF-κB表達減少。見圖3。NF-κB主要在新生內膜中表達。葉酸組兔腹主動脈新生內膜NF-κB陽性細胞百分比與模型組比較未見明顯減少(P>0.05)，GSH組與模型組比較顯著減少(P<0.05)。見表4。

圖1 各組兔腹主動脈新生內膜厚度(HE,×100)

圖2 各組兔腹主動脈橫切面粥樣硬化斑塊形成情況(油紅O染色，×200)

圖3 各組兔腹主動脈NF-κB表達(DAB，×200)

表4 各組腹主動脈病理結果分析

3 討 論

HCY為一種含硫氨基酸，為體內蛋氨酸代謝的一個重要中間代謝產物。人體內的HCY主要由飲食攝取的蛋氨酸在肝臟、肌肉及其他一些組織中脫甲基生成。蛋氨酸在ATP酶作用下轉化為S-腺苷蛋氨酸，S-腺苷蛋氨酸在甲基轉移酶的作用下轉化為S-腺苷同型半胱氨酸，進一步去腺苷后生成HCY〔5〕。本研究發現2%蛋氨酸喂養模型組兔子2 w，HCY已經明顯升高至對照組水平的5倍，喂養至12 w，模型組兔子HCY上升至對照組水平的8倍。HCY在體內的代謝通路包括〔6〕：①重甲基化途徑：在二甲基四氫葉酸還原酶催化下，以維生素B12作為輔基，重新甲基化生成蛋氨酸(甲硫氨酸)。②甲基化的替代途徑：由甜菜堿提供甲基，在甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉移酶(BHMT)催化下，生成蛋氨酸及二甲基甘氨酸，在肝臟完成。③ 轉硫途徑：HCY經轉硫途徑不可逆生成胱氨酸和α-酮丁酸、硫酸和水，此過程需維生素B6依賴的胱硫醚β合成酶參與。④HCY在重金屬離子(Fe3+或Ca2+)存在下，自身氧化。⑤釋放到細胞外液。本研究結果表明，口服葉酸可以促進HCY代謝，降低血液中HCY水平，但未明顯影響血脂水平。GSH是人類細胞質中自然合成的一種肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，含有巰基(-SH)，廣泛分布于機體各器官內。外源性補充GSH不但可以降低HH，還能降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C的水平。GSH降低HH的機制可能是通過GSH的轉甲基作用促進蛋氨酸循環。GSH調脂作用機制可能是通過轉甲基、轉丙氨基反應，促進肝臟合成HDL，運載周圍組織中的膽固醇，再轉化為膽汁酸或直接通過膽汁從腸道排出。

氧化應激是指機體或者細胞內氧自由基的產生與清除失衡，或外源性氧化物質的過量攝入，導致ROS在機體或細胞內蓄積而引起的細胞毒性過程〔7〕。ROS在動脈粥樣硬化的發生發展過程中扮演著十分重要的角色。在線粒體內進行的氧化磷酸化過程中，氧分子通過單電子接受反應，轉變為超氧陰離子自由基(O2ˉ·)、過氧化氫(H2O2)及羥基自由基(·OH)等中間產物，并最終轉化為水。這些中間產物由氧分子轉化而來，具有比氧分子更活潑的化學反應性，統稱為ROS〔8〕。ROS在SOD的催化作用下能夠產生歧化反應，從而被清除，以保護機體細胞免受自由基的攻擊和損害。SOD是機體內廣泛存在的一種金屬抗氧化酶類〔9〕，廣泛存在于動物血液和植物種子中。本研究表明，5%脂肪+2%蛋氨酸飼料喂養12 w后，模型組兔子ROS顯著升高，SOD也相應升高。葉酸未能明顯影響ROS和SOD的水平。GSH顯著降低了ROS水平，升高了SOD水平，使血液中ROS的產生與清除趨向平衡。

本研究表明，HH、高脂血癥和動脈內膜的機械損傷共同作用可以導致明顯的動脈粥樣硬化。其可能的機制包括〔10〕：①HH通過自身氧化、HCY二硫化物的形成、Hcy硫內酯的形成及蛋白質的Hcy化生成H2O2和氧自由基，對內皮細胞有直接的細胞毒性作用。②HH、高脂血癥和動脈內膜的機械損傷可促進血管平滑肌細胞增殖遷移。③HH和高脂血癥促進LDL-C氧化為ox-LDL，后者被巨噬細胞吞噬后成為泡沫細胞，啟動動脈粥樣硬化過程。④氧自由基攻擊生物膜中的多鏈不飽和脂肪酸引發脂質過氧化作用。本研究結果表明，術后12 w，模型組兔子ox-LDL水平顯著升高，葉酸未能明顯影響ox-LDL水平，而GSH明顯降低了ox-LDL水平。GSH可能是通過巰基與體內的自由基結合，轉化成容易代謝的酸類物質從而加速自由基的排泄，降低了LDL-C的氧化反應及膜脂質過氧化作用。

NF-κB是一類特殊的蛋白質，具有和基因啟動子區的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄的功能，參與調控許多與動脈粥樣硬化有關的靶基因的表達，在細胞增殖、分化中起重要作用〔11〕。NF-κB的異常激活是體內氧化應激反應放大和持續的分子生物學機制，是HH致動脈粥樣硬化發生的始動機制之一〔12〕。HH誘導超氧陰離子的產生增加，對動脈粥樣硬化早期NF-κB的激活起一定作用〔13〕。本研究中NF-κB主要在新生內膜中表達，提示動脈粥樣硬化主要發生在新生內膜。免疫組織化學結果表明葉酸未能明顯影響NF-κB的活性，GSH可以明顯抑制NF-κB的活性，提示GSH可能通過調節NF-κB的活性來影響動脈粥樣硬化。

總之，GSH可以通過降低血清HCY、調節血脂水平、抗氧化應激及調節NF-κB的活性等途徑抑制動脈粥樣硬化，可以推測聯合葉酸、維生素B6、B12及還原型谷胱甘肽來防治HH所致動脈粥樣硬化會有良好的應用前景。