補腎通絡方對骨質疏松大鼠骨吸收的影響

閔 文 韓 龍 韓詩雨 尚宜志 吳銘杰 方彭華 袁 翰 黃桂成

(南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京 210023)

骨質疏松(OP)是以骨量減少、骨組織微結構退化為特征，導致骨脆性增加進而易發生骨折的一種全身性骨代謝疾病〔1〕。隨著生活水平的提高，人口老齡化日趨明顯。流行病學調查顯示，我國現有老齡人口約1.3億,OP患者達8 400萬人，預計到2050年，我國老齡人口將達到2.5億，其中25%～70%可能患有OP〔2〕。絕經后婦女患OP高達40%〔3〕，世界范圍內每年因OP引起的骨折有900萬例〔4〕。OP已成為亟待解決的嚴重的社會公共衛生問題。細胞核因子κΒ受體活化因子配體(RANKL)可促進破骨細胞的分化，增強成熟破骨細胞的活力，阻止破骨細胞凋亡，是破骨細胞分化成熟和維持功能所需的重要因子。骨保護素(OPG)蛋白能明顯抑制破骨細胞的形成，并引起骨密度(BMD)的升高〔1〕。在骨組織中，OPG作為一種誘騙受體，可以競爭性地與RANKL結合，從而阻止RANKL與破骨細胞表面的RANK結合，抑制破骨細胞的分化成熟〔5，6〕。因此，RANKL/OPG的比值對破骨細胞的分化有著直接影響。補腎通絡方是基于臨床經驗總結及動物實驗研究得到的經驗方，該方對OP患者及OP大鼠的骨量減少都有改善〔7，8〕。但是，目前對于補腎通絡方影響骨吸收的機制尚不明確。本研究通過建立去卵巢OP模型大鼠，觀察補腎通絡方對大鼠血清白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α及骨代謝相關因子RANKL/OPG的影響，探討補腎通絡方對OP大鼠骨吸收的影響機制。

1 材料與方法

1.1動物及材料 6月齡SD系SPF級雌性大鼠104只，體重260～280 g。動物購于浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK(浙)2014-0001。中藥：補腎基礎方、通絡方、補腎通絡方均由江蘇省中醫院制劑室提供，含生藥1.0 g/ml。補腎基礎方:淫羊藿、骨碎補、續斷、茯苓、白芍、甘草等組成。通絡方:蜈蚣、全蝎等組成。補腎通絡方:淫羊藿、骨碎補、續斷、蜈蚣、全蝎、茯苓、白芍、甘草等組成。西藥：阿侖膦酸鈉、氟化鈉。

1.2儀器與試劑 MultiGene Gradient PCR 循環儀(美國Labnet)，HH-4 數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司) UV-2450，SHIMADZU 紫外光度儀(日本島津公司)，Western印跡電泳槽、電源(美國Bio-Rad)。凱基全蛋白提取試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20161013。一抗：OPG(H-249)：Santa Cruz Biotechnology，貨號：sc-11383；RANKL(C-20)：Santa Cruz Biotechnology，貨號：sc-7627；β-actin，北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-0061R。二抗：抗兔IgG，Cell Signaling Technology，#7074；HRP 兔抗山羊，武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1060。

1.3方法

1.3.1模型建立及給藥 將大鼠隨機分為假手術組和模型組，分別為22只和82只。全部動物按照300 mg/kg水合氯醛腹腔麻醉。用碘伏行皮膚消毒后，用手術剪刀沿后正中線切開皮膚，切口長約2 cm。于肋弓下脊柱旁開1 cm處切開肌肉，打開后腹膜。找到位于腎臟后下方的脂肪團，將卵巢輕柔提出，并分離周圍脂肪組織，結扎雙側卵巢下方的輸卵管、血管。切除雙側卵巢，放入固定液固定。然后逐層縫合，在每側手術部位注射青霉素1 ml。假手術組僅切除雙側卵巢旁部分脂肪，余處理同模型組。術后每天青霉素鈉鹽，連續3 d。術后70 d從兩組分別隨機選出10只大鼠處死后取右側股骨，去除附著肌肉和結締組織，采用雙能 X 射線骨密度(BMD)儀進行檢測，以驗證造模是否成功。造模成功后，假手術組剩下 12 只，模型組大鼠隨機分為6組：模型組、補腎基礎組、通絡組、補腎通絡組、阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組各12只。給予補腎通絡組6.3 g/kg、補腎基礎組5.4 g/kg、通絡組0.9 g/kg水提液灌胃〔8〕，阿侖膦酸鈉組1 mg/kg，氟化鈉組5 mg/kg藥物溶解液。1次/d，共70 d。

1.3.2取材及樣本處理 給藥結束后，動物空腹12 h，采用7%水合氯醛(300 mg/kg)進行腹腔麻醉。待麻醉生效后，用5 ml一次性注射器從大鼠腹主動脈抽取血液，轉入血液采集管，標記及記錄。接著取出大鼠股骨，剔除軟組織及骨膜，用4℃預冷的生理鹽水沖洗干凈后，用鋁箔紙包裹并標記，放入-80℃中凍存。

1.3.3血清學檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢查血清IL-1、IL-6、TNF-α。

1.3.4BMD檢測 采用雙能X線吸收法測定BMD。

1.3.5Western印跡法檢測骨組織RANKL/OPG蛋白的表達 用液氮將骨組織研磨至粉末狀，將粉末轉入預冷的離心管，按0.2 g/ml的比例加入裂解液劇烈震蕩，以使組織充分裂解。3 000 r/min離心，取上清得到骨組織蛋白。通過氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測得其濃度。依據所得蛋白濃度調整煮樣的濃度，然后，12%分離膠中加入30 μg樣品。接著將分離的蛋白轉到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；室溫封閉2 h；一抗4℃過夜，次日1×TBST洗3次，每次10 min；然后室溫孵育二抗2 h。最后，通過超敏發光液看到免疫反應條帶并且通過Bio-Rad軟件定量。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析及χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比較 與假手術組相比，模型組IL-1、IL-6明顯增加(P<0.05)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組、補腎通絡組及通絡組IL-1、IL-6均顯著減少(P<0.01),補腎基礎組無明顯變化(P>0.05)。與假手術組相比，模型組大鼠TNF-α顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組、補腎通絡組及補腎基礎組TNF-α均明顯減少(P<0.05)，通絡組TNF-α顯著減少(P<0.01)。見表1。

2.2各組BMD水平比較 與假手術組相比，模型組BMD顯著減少(P<0.01)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組和補腎通絡組BMD均顯著增加(P<0.01),氟化鈉組、通絡組及補腎基礎組BMD均明顯增加(P<0.05)，見表2。

2.3檢測各組RANKL/OPG蛋白表達水平比較 與假手術組相比，模型組RANKL/OPG蛋白比值顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組和補腎基礎組RANKL/OPG蛋白比值均明顯減少(P<0.05),氟化鈉組、補腎通絡組及通絡組RANKL/OPG蛋白比值均顯著減少(P<0.01)，見表2，圖1。

表1 各組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比較

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01;下表同

表2 各組RANKL/OPG蛋白表達水平比較

圖1 Western印跡檢測各組RANKL/OPG蛋白表達

3 討 論

中醫自古就有“七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子”、“精傷則骨酸痿厥”、“腎虛則骨枯髓減”等論述，表明絕經后骨質疏松癥以“腎虛-本痿”為根本病機，屬“骨痿”范疇。臨床上從“骨痿”論治絕經后骨質疏松癥，其療效確切。遵循“欲壯其骨，當補其腎”治則，左歸丸、右歸丸、二至丸等補腎經方及補腎為主的骨康膠囊、骨疏康顆粒、仙靈骨葆片等臨床驗方〔9～15〕，均有效治療絕經后骨質疏松癥和降低骨折風險。本研究顯示，與假手術對照組相比，骨質疏松模型組大鼠實驗前后骨密度顯著減少。與之前研究一致，阿侖膦酸鈉能夠顯著增加骨質疏松模型大鼠骨密度。本文發現，補腎中藥組、通絡藥組及補腎通絡方組骨密度均明顯增加,尤其要指出的是，補腎通絡方組骨密度增加優于補腎中藥組以及通絡藥組，這些研究提示補腎通絡方及方中兩藥協同增加骨密度，具有治療骨質疏松效果。

全蝎、蜈蚣等蟲類藥是最具代表性的通絡中藥，善于“搜剔絡中混處之邪”，對骨質疏松癥、骨關節炎等骨性頑痹療效顯著〔16〕。早在《神農本草經》中就有關于全蝎、水蛭、僵蠶等蟲類藥記載。張仲景認為蟲類藥對深伏經絡之邪具有草木之藥不可比擬的治療優勢，并首創蟲類搜剔通絡法。現代藥理研究發現，全蝎、蜈蚣等蟲類藥透骨搜邪和通絡止痛功效是通過抑制TNF-α、 IL-1、IL-6等致炎因子實現，而這些致炎因子廣泛作用于絕經后骨質疏松癥骨形成/骨吸收病理過程〔17～19〕。本實驗結果發現，補腎中藥組、通絡中藥組及補腎通絡方組均能夠降低骨質疏松模型大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α顯著降低，提示補腎通絡方及方中兩藥能夠抑制炎性因子表達，尤其是通絡藥抑炎效果顯著，從而導致骨吸收過程明顯減少，提高骨密度。

OPG/RANK/RANKL信號通路是調節骨重建過程中破骨細胞功能的重要通路。成骨細胞釋放的RANKL與破骨細胞表面的RANK結合后通過NF-Kb途徑、JNK途徑、蛋白激酶B途徑等促進破骨細胞的分化和激活;OPG則可競爭性抑制RANK與RANKL的結合,抑制破骨細胞功能,減少骨吸收〔20〕。因此，RANKL/OPG蛋白比值與骨量及骨密度呈負相關。本次研究結果顯示，阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組、補腎中藥組、通絡中藥組及補腎通絡方組RANKL/OPG蛋白比值均顯著下降。實驗已證實可以降低RANKL/OPG蛋白比值，抑制破骨細胞增殖活化，減少骨吸收〔9,21〕。此外，通絡中藥組及補腎通絡方組RANKL/OPG均顯著減少，提示通絡中藥及補腎通絡方中兩藥能夠協同降低RANKL/OPG蛋白比例，抑制破骨細胞增殖活化，減少骨吸收，增加骨密度，逆轉骨質疏松癥。因此，通絡法及蟲類通絡中藥是“補腎”治療的必要補充。