電針對腦卒中后抑郁大鼠腦神經細胞γ-氨基丁酸、血管內皮生長因子表達的影響

趙立峰 傅潤熹 嚴嘉寧 余 濤 陸方琴 韋登明

(寧波大學醫學院病理教研室，浙江 寧波 315211)

針刺治療腦卒中后抑郁(PSD)在臨床上有確切的療效〔1〕，但其治療機制尚不完全清楚。普通抑郁癥的發病與谷氨酸與γ-氨基丁酸(GABA)及其受體變化有關； GABA及其受體表達增多具有神經毒作用，通常認為缺血使興奮性氨基酸增加，胞內Ca2+聚集，繼而引發一系列反應，最終導致神經元死亡。腦缺血過程中伴有的血管內皮生長因子(VEGF)表達水平變化與缺血性腦血管病的發生、發展及預后密切相關。VEGF除了通過調控新生血管的形成對缺血性腦損傷后的神經細胞具有直接的營養和保護作用外，還具有其他多種直接和間接的神經保護作用〔2〕。針刺是一種安全無毒療效顯著的治療手段，經過前期研究工作的積累，已經確定其對PSD有治療效果〔3〕。但PSD的發病及電針治療機制是否與腦神經細胞GABA及VEGF的表達含量變化有關尚未見報道。本實驗旨在通過檢測電針對PSD大鼠腦神經細胞GABA及VEGF表達含量的影響，研究電針對PSD的治療效果和相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 Wistar大鼠40只，購于浙江大學醫學院實驗動物中心，合格證號0102016。均為雄性，體重280～320 g，自由飲食。大鼠適應性喂養7 d后，分為正常組，假手術組，模型組和電針組，每組10只。

1.2試劑儀器 G6805 電針儀(上海華誼儀器制造廠生產)，曠場及記錄儀(上海移數動物學系統)，兔抗大鼠GABA多克隆抗體、兔抗大鼠VEGF多克隆抗體、生物素化羊抗兔 IgG、鏈霉親合素-生物素(SABC)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，JD801形態學圖像分析系統(江蘇捷達科技發展有限公司)，BM-Ⅶ包埋機(宏業醫用儀器公司)；HM-325石蠟切片機(德國LEICA公司)；CX40生物顯微鏡(日本olympus公司)。

1.3模型制備 以10%水合氯醛0.3 ml/100 g，腹腔麻醉，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切開皮膚，暴露雙側頸總動脈(CCA)和迷走神經。將CCA用動脈夾夾閉10 min，再通20 min，再夾閉10 min。以青霉素局部消毒再縫合，放回鼠籠中保溫飼養。假手術組麻醉及手術過程同上，但不夾閉CCA。飼養7 d后進行行為學檢測。對腦卒中模型成功大鼠予以孤養、慢性不可預見的溫和性應激(CUMS)制備PSD模型〔4〕：①禁食禁水20 h；②禁水17 h；③傾斜鼠籠(45°)17 h；④持續光照17 h；⑤濕籠(100 g鋸屑+200 ml水)21 h；⑥4℃強迫游泳5 min；⑦水平搖晃5 min；⑧行為限制(束縛)2 h；⑨夾尾1 min。9種刺激每日隨機采取1種，共21 d，單籠飼養，再次進行行為學檢測。

1.4電針治療方法 PSD模型成功后，電針“百會”、“大椎”，“百會”位于頂骨正中，“大椎”在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。施以連續波，頻率50 Hz，強度以大鼠安靜耐受為度(約2.0 rflA)，每天電針1次，留針20 min，連續治療15 d。

1.5檢測方法

1.5.1行為學檢測 采用曠場試驗(open-field)法〔5〕，用小動物行為學分析系統測定5 min內大鼠穿線次數和抬壁次數，其中第1分鐘不計時，大鼠適應環境，保持環境安靜與黑暗。

1.5.2腦組織GABA和VEGF免疫組織化學染色觀察 以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g體重)，暴露心臟，先以生理鹽水100 ml經主動脈沖洗，繼續灌注由4%多聚甲醛與1%戊二醛組成的磷酸緩沖液(pH7.4)200 ml，再持續滴注40 min，斷頭取腦。石蠟包埋切片后進行免疫組織化學染色。切片經常規脫蠟、脫水、3%H2O2滅活內源性酶、微波抗原修復，正常山羊血清封閉，分別滴加VEGF和GABA一抗，濕盒中4℃冰箱過夜。滴加相應二抗，SABC反應，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。分色、脫水、透明、封片、光學顯微鏡下觀察免疫組化染色結果。陰性對照：用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗；陽性區域為棕黃色，400倍光鏡下，每張切片隨機選取4個視野檢測，計算平均積分光密度。

1.6統計學檢測 采用SPSS13.10軟件行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。

2 結 果

2.1電針治療對大鼠行為學表現的影響 正常組與假手術組穿線次數〔(17.10±4.90)次 vs (13.6±3.43)次〕、抬壁次數〔(14.1±3.41)次vs(12.3±3.71)次〕的差異無統計學意義(P>0.05)，但模型組的穿線次數〔(8.29±2.75)次〕、抬壁次數〔(5.71±1.80)次〕較正常組和假手術組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；電針治療后，電針組的穿線次數〔(9.36±4.39)次〕、抬壁次數〔(7.10±5.15)次〕較模型組明顯提高，差異有統計學意義(P<0.05)。提示電針對PSD大鼠的抑郁有改善作用。

2.2電針對腦組織GABA、VEGF表達的影響 模型組GABA明顯升高，腦神經細胞染色呈強陽性；與模型組比較，電針組GABA表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組VEGF的表達較假手術組升高，電針組VEGF的表達與模型組比較明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1，圖2，表1。

圖1 GABA免疫組織化學染色圖(×400)

圖2 VEGF免疫組織化學染色圖(×400)

表1 電針對大鼠腦組織GABA及VEGF表達的影響

3 討 論

急性腦卒中患者預后最常見的精神心理障礙就是抑郁。據相關報道，急性腦卒中患者并發抑郁最高可達60%〔6〕。針刺作為中醫治療的一種手段，具有安全、無毒、療效顯著等優點。PSD患者更易出現認知功能損害，電針抗抑郁治療后抑郁癥狀緩解，認知功能亦可好轉〔7〕。針刺治療 PSD 的效果與口服鹽酸氟西汀膠囊相當，且具有起效快、副反應小、明顯提高患者生存質量的優越性。然而，針刺治療PSD的機制尚不十分清楚，限制了針灸療效的進一步提高。百會位居巔頂，與大椎均為諸陽之會，刺之可調動一身之陽氣；喬瑞瑞等〔8〕研究表明電針此兩穴對慢性抑郁確有療效。本研究提示，電針對PSD大鼠的行為表現有改善作用，提示電針百會與大椎穴位有改善PSD的效果。

堿性成纖維生長因子(bFGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、VEGF及表皮生長因子(EGF)等均可促進海馬神經干細胞的增殖與分化〔9〕。抑郁癥患者海馬體積縮小，神經元的修復可以使其恢復正常。大腦海馬部有較多的生長因子(如bFGF、EGF、VEGF)〔10〕，本實驗結果提示電針百會與大椎穴位可促進腦神經細胞高表達VEGF，再次印證了海馬VEGF對神經元的修復與再生是有重要意義的。筆者推測，電針通過促進腦神經細胞VEGF高表達，提高神經元修復能力，達到抗PSD的治療效果。

腦卒中時，GABA(抑制性遞質)與谷氨酸(興奮性遞質)對腦神經細胞有較大的毒性，PSD的發生機制與GABA表達失衡有明顯關系。本實驗免疫組織化學染色結果提示GABA高表達參與PSD的發病過程，電針可抑制PSD大鼠腦神經細胞GABA的表達。

綜上所述，電針對PSD有一定的治療效果，其機制可能與下調腦神經細胞GABA水平和促進對神經損傷有修復效果的VEGF高表達有關。