皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞凋亡及端粒酶的影響

張 妍 阮連國 曾友玲 曾 潔

(武漢市婦女兒童醫療保健中心，湖北 武漢 430032)

皂莢是常用抗癌中草藥之一，臨床可用于乳腺癌、宮頸癌、肝癌等的治療。研究顯示，皂莢提取物濃縮液對血液系統腫瘤、前列腺癌、乳腺癌等癌細胞的生長具有一定的抑制作用〔1，2〕。目前為止，皂莢提取物對宮頸癌的抑制作用及其機制國內外暫無相關報道。本實驗旨在探討皂莢提取物對人宮頸癌Hela細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌Hela細胞株購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。皂莢提取物由廣州中醫藥大學中藥學院提供，皂莢生藥濃度為2.0 g/ml。Bcl-2單抗、Bax單抗、p53超敏S-P(鼠)試劑盒(Gibco公司)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Hyclone公司)，TIANampGenmic基因組DNA提取試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)，PCR-ELISA端粒酶試劑盒(福建邁新公司)，EPICSELTE ESP型流式細胞儀(美國COUITER公司)，LH50A型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，酶標儀器(美國Bio-Rad公司)、TC2323型CO2培養箱(美國SHELDON公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人宮頸癌Hela細胞復蘇后，接種于RPMI1640完全培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，實驗在細胞對數生長期進行。

1.2.2MTT法檢測皂莢提取物對Hela細胞生長的抑制情況 將傳代的人宮頸癌Hela細胞調整濃度為5×104個/ml，每孔0.2 ml接種于96孔培養板中。隨機分為對照組、皂莢提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml組，每組6復孔。對照組不加藥物，皂莢提取物各組加0.2 ml藥物，培養48 h，加入5 mg/ml MTT貯液20 μl，繼續培養3 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)0.2 ml，振蕩10 min，用全自動酶標儀于490 nm波長處測定各孔吸光度A值，取平均值，利用公式計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=(對照組A值-實驗組A值)÷對照組A值×100%。

1.2.3流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 各組Hela細胞在相應培養液中培養72 h后，收集，1 000 r/min低溫條件下離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，調整細胞濃度為1×106/ml，加RNaseA，37℃水浴30 min，加磺化丙啶(PI)染色，低溫避光30 min，用流式細胞儀檢測細胞DNA含量，分析各組宮頸癌Hela細胞的凋亡率。

1.2.4免疫組化法檢測Bax、Bcl-2、p53蛋白表達 取對數生長期宮頸癌Hela細胞，接種于24孔培養板，1×105個/孔，培養24 h后，隨機分為對照組、皂莢提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml組，每組4復孔。對照組不加藥物，皂莢提取物各組加0.2 ml藥物，繼續培養48 h，爬片，PBS沖洗3次，加4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌2次，按免疫組化試劑盒說明書操作檢測Bax、Bcl-2、p53蛋白表達情況。胞質或胞核染成黃色或棕黃色為陽性反應，反之則為陰性。

1.2.5Hela細胞端粒酶活性檢測 按照端粒酶試劑盒說明書操作方法測定：將生長期宮頸癌Hela細胞分別于無藥物培養液、皂莢提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml培養液中培養，72 h后收集各組細胞，加入CHARPS裂解液0.2 ml，制成懸浮細胞。冰浴中包被30 min，以15 000 r/min低溫條件離心15 min，取上清得到含端粒酶的細胞提取物，置于PCR管中，加入反應液，30℃條件下反應30 min，然后進行PCR(33個循環94℃、30 s，55℃、30 s)。使用阻斷稀釋緩沖液2次，加反應液5 μl，37℃條件下孵育60 min，PBS沖洗，每孔加入抗二氨基庚二酸(DAP)抗體0.1 ml，包被30 min，PBS沖洗，加四甲基聯苯胺(TMB)室溫包被5 min，加入0.1 ml終止液，用全自動酶標儀于450 nm波長處測定各孔吸光度A值，取平均值，計算端粒酶活性抑制率。端粒酶活性抑制率=(對照組A值-實驗組A值)÷對照組A值×100%。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞增殖的影響 不同濃度的皂莢提取物對Hela細胞增殖具有明顯的抑制作用，組間差異有統計學意義(P<0.05)，其中1.0 mg/ml皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞生長抑制率最高，且有一定的劑量依賴性。見表1。

2.2皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞周期的影響 不同濃度的皂莢提取物對Hela細胞周期作用72 h后，與對照組比較，在G0～G1期百分比升高，S期百分比降低，提示皂莢提取物阻止Hela細胞從G0～G1期進入S期，阻止DNA的無限繁殖，誘發宮頸癌Hela細胞凋亡。見表2。

表1 皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與0.1 mg/ml組比較：2)P<0.05；與0.5 mg/ml組比較：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

表2 皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞周期的影響

2.3皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞凋亡基因的影響 與對照組相比，皂莢提取物使宮頸癌HeLa細胞中p53和Bax表達顯色加深，差異有統計學意義(P<0.05)，而Bcl-2基因表達差異無統計學意義(P>0.05)。隨著皂莢提取物給藥濃度升高，對p53和Bax的表達具有一定的增高趨勢。見表3。

表3 皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞凋亡基因表達陽性率比較

2.4皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞端粒酶活性的抑制 與對照組相比，不同濃度皂莢提取物組宮頸癌Hela細胞端粒酶均顯著下降(P<0.05)，表明皂莢提取物可抑制人宮頸癌Hela細胞端粒酶活性，其中高濃度組對人宮頸癌Hela細胞端粒酶活性的抑制具有最顯著的效果(P<0.01)。見表4。

表4 皂莢提取物對宮頸癌Hela細胞端粒酶活性的抑制

3 討 論

宮頸癌是最常見的一種婦科生殖系統惡性腫瘤，惡性程度高、死亡率高，且治療后易復發，致病因素復雜，可能是病毒感染、宮頸組織病變、患者免疫功能減弱及社會環境因素等綜合作用的結果〔3～7〕。目前臨床上對宮頸癌的治療以化學合成藥物為主，但化療藥物常伴隨產生毒副作用，持續用藥又容易引起耐藥性。因此，尋找高效低毒天然來源中藥改變宮頸癌的生物學行為已成為治療宮頸癌藥理學領域的熱點。

研究發現，皂莢提取物對乳腺癌、前列腺癌和肝癌等癌細胞具有明顯的抑制作用〔8〕。本實驗結果顯示，皂莢提取物對人宮頸癌Hela細胞增殖具有明顯的抑制作用，并可誘導Hela細胞的凋亡。

Bax、Bcl-2為同源二聚體，兩者在細胞內的比例變化直接影響細胞的抑制或促進凋亡程度。當Bax占優勢時可誘導細胞的凋亡，反之，Bcl-2占優勢時卻抑制細胞的凋亡〔9，10〕。而p53主要影響細胞的修復及凋亡，對細胞周期調節因子具有一定的抑制作用，當細胞受到損傷時p53會被立即激活，使細胞停頓在G1期以便DNA得到修復，或指示其進入凋亡，阻止細胞持續分裂和癌變〔11〕。從本實驗結果分析可知，皂莢提取物阻止Hela細胞從G0～G1期進入S期，阻止DNA的無限繁殖，誘發宮頸癌Hela細胞凋亡。另外，隨著皂莢提取物給藥濃度的升高，p53和Bax的表達具有一定的升高趨勢。

端粒酶是一種核糖蛋白體酶，在細胞復制過程中維持染色體端粒長度的穩定。研究顯示，端粒酶活性在多數腫瘤細胞中表達，與調控細胞增殖周期密切相關〔12〕。端粒酶活化是所有惡性腫瘤發生過程的一個必經之路，癌基因的激活或抑癌基因的失活引起細胞端粒的丟失與重新組合，導致惡性腫瘤細胞無限繁殖下去〔13〕。實驗結果也顯示，皂莢提取物可抑制人宮頸癌Hela細胞端粒酶活性。

本實驗研究提示，皂莢提取物可明顯抑制人宮頸癌Hela細胞增殖，誘導Hela細胞的凋亡，抑制Hela細胞端粒酶的活性，阻止Hela細胞的無限繁殖。其作用機制可能是抑制癌細胞活化的端粒酶，阻止癌細胞復制過程中DNA的無限繁殖，同時增加抑癌基因的活性，使癌細胞凋亡。