老齡大鼠血清非對稱性二甲基精氨酸濃度變化及其與心肌細胞衰老的關系

楊 凡 熊學麗

(荊門市第二人民醫院心內科，湖北 荊門 448000)

心肌細胞是終末分化細胞，隨著增齡不斷衰老，且數量不斷減少，在衰老相關性心血管疾病和心功能下降中，心肌細胞的衰老發揮著重要作用。衰老的發生發展和線粒體功能障礙、衰老相關基因的改變、氧化應激等關系密切。老年人群線粒體生物合成和數量減少，ATP生成下降，線粒體功能障礙。老年人群的衰老基因表達和活性升高，長壽基因的表達和活性下降〔1～4〕。老年人對活性氧的抑制作用下降，活性氧的生成增加，氧化損傷分子增多。一氧化氮(NO)是心血管活性物質，對心血管發揮保護作用〔5〕，非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶(NOS)的抑制物，抑制NO的生成〔6〕。 本文對老齡大鼠血清中ADMA水平進行研究，并探討其與心肌細胞衰老的關系。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物及分組：選擇12只23月齡、清潔級、雄性、健康Wistar大鼠作為老年組，12只4月齡、清潔級、雄性、健康Wistar大鼠作為青年組。

1.2實驗方法

1.2.1標本采集 將老年組和青年組大鼠麻醉成功后抽取頸動脈血離心，留取血清用于血清生化指標檢查。處死大鼠，留取心肌組織進行RT-PCR測定。

1.2.2生化指標 取離心后血清采用高效液相色譜法測定ADMA水平；空腹血糖(FPG)采用血糖儀進行測定；血液加入氰化高鐵血紅蛋白測試液，分光光度計測定540 nm處光密度值，以10 g血紅蛋白的吸光度表示糖化血紅蛋白(HbA1c)結果；血漿胰島素采用競爭性放射免疫分析法進行測定；總膽固醇(TC)采用固醇氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法進行測定；三酰甘油(TG)采用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法測定；低密度脂蛋白(LDL)采用聚乙烯硫酸沉淀法測定；高密度脂蛋白(HDL)采用磷鎢酸鎂沉淀法測定。

1.2.3心肌組織中二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)活性、NOS活性和NO含量測定 心肌組織中DDAH活性采用考馬斯亮藍試劑盒進行測定，取心肌組織上清和ADMA反應，以沒有加ADMA反應體系者作為陰性對照組，DDAH活性值為心肌組織和ADMA反應測得的數值減去陰性對照組的數值。NOS活性按照試劑盒說明進行測定，測量管取心肌組織上清，空白管取雙蒸水，每管加入底物緩沖液反應后，測量530 nm波長處的光密度值，計算NOS活性。心肌組織中NO含量采用硝酸還原酶法進行測定。

1.2.4心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平測定 提取心肌組織總RNA，采用RT-PCR法測定心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平，均以GAPDH為內參照，P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA相對表達量為目的基因與GAPDH的相對灰度值。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件行t檢驗、Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1老年組和青年組血清ADMA和血糖血脂水平比較 老年組血清ADMA水平明顯高于青年組(P<0.05)，FPG和胰島素水平低于青年組(P<0.05)，血清TC、LDL水平高于青年組(P<0.05)，血清HDL水平低于青年組(P<0.05)；兩組血清TG水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組血清ADMA和血糖、血脂水平比較

2.2兩組心肌組織中DDAH活性、NOS活性和NO含量比較 老年組心肌組織中DDAH活性、NOS活性和NO含量低于青年組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組心肌組織中DDAH活性、NOS活性和NO含量比較

2.3兩組心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平比較 老年組心肌組織中P21 mRNA和P53 mRNA水平高于青年組(P<0.05)，Sirt1 mRNA水平低于青年組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平比較

2.4老年組血清ADMA水平和心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平相關性 老年組血清ADMA水平與心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA水平呈正相關(r=0.692，0.681；均P<0.05)，與心肌組織中Sirt1 mRNA水平呈負相關(r=-0.562，P<0.05)。

3 討 論

衰老是生命的基本現象，在分子水平、細胞水平、組織器官水平、整體水平等各個層次均有衰老過程的發生。細胞衰老時，和衰老有關的蛋白質含量和活性發生變化，如超氧化物歧化酶的表達和活性下降，β-半乳糖苷酶的表達和活性升高，都是細胞衰老的標志。衰老也是心血管疾病的主要危險因素，對衰老相關的心血管疾病進行研究具有重要意義。NO在衰老相關的心血管疾病的發生發展中具有重要意義，是一種內源性的血管活性物質，由eNOS催化L-精氨酸轉化而來，由eNOS合成的NO在心血管系統中具有調節血管張力、介導血管內皮依賴性舒張、抑制血小板聚集、抗白細胞黏附、抗血管平滑肌細胞增殖等作用，對心血管具有保護作用；隨著年齡的增加，細胞內產生的NO減少，和NO有關的功能下降〔7〕，其機制可能和內源性L-精氨酸含量下降有關。ADMA為L-精氨酸的同系物，是NOS的內源性抑制物，ADMA水平升高對eNOS合成NO具有抑制作用〔8～10〕，從而對心血管疾病的發生有促進作用；內源性ADMA多數由DDAH代謝為二甲胺和L-胍氨酸，少數經腎臟排出，因此DDAH是ADMA濃度重要的調節因子。本研究結果發現，老年大鼠血清ADMA水平升高，血糖和胰島素水平降低，存在血脂異常，心肌組織中DDAH活性、NOS活性和NO含量降低，表明ADMA可能通過抑制NOS合成NO，降低心肌組織中NO含量，并使L-精氨酸之間電子傳遞脫耦聯。L-精氨酸為NO和NOS合成前體，從而使O2成為受電子體，使超氧陰離子水平升高，誘導氧化應激的發生，從而和心肌細胞的衰老有關，增加心血管疾病的發生風險。

P21能夠結合細胞周期蛋白依賴性激酶4和細胞周期蛋白依賴性激酶2，從而抑制兩種細胞周期蛋白依賴性激酶的活性，對RB蛋白的磷酸化有阻斷作用，使細胞周期停滯在G1期，從而降低細胞的增殖能力，誘導細胞的衰老；P21還能夠抑制增殖細胞核抗原的活性，增殖細胞核抗原是DNA多聚酶輔助因子，引起P21能夠抑制S期DNA合成，將細胞周期阻滯在G1期〔11，12〕。P53為抑癌基因，在靜息狀態下P53水平很低，在氧化應激、DNA損傷、滲透壓休克等各種應激時P53被活化，P53能夠誘發細胞凋亡、介導細胞生長阻滯、活化DNA修復蛋白，從而抑制腫瘤的發生，在細胞衰老過程中，P53蛋白的體內轉錄活性和體外DNA結合活性增加，可能通過和DNA結合誘導P21表達，介導細胞周期阻滯在G1期，從而發揮阻止細胞生長的作用〔13，14〕。Sirt1為長壽基因，在生物體衰老過程中發揮重要作用。Sirt1通過對其他蛋白、轉錄因子、組蛋白的賴氨酸殘基進行去乙酰化，對基因的表達進行調節，發揮復制性衰老，調節細胞壽命等功能〔15，16〕。本研究結果發現，ADMA促進心肌細胞衰老的機制可能和心肌組織中P21 、P53、Sirt1的表達水平有關，心肌組織中P21和P53水平升高，使心肌細胞周期阻滯在G1期，從而誘導心肌細胞衰老；心肌組織中Sirt1水平降低，使心肌細胞的壽命減少，從而促進心肌細胞的衰老。