硫化氫在外源性SB203580預處理人卵巢癌細胞增殖與凋亡中的作用

呂錫芳 陳志剛 何雄偉

(石河子大學醫學院第一附屬醫院婦產科，新疆 石河子 832000)

尋找能夠抑制卵巢癌細胞增殖，抑制其進展的藥物或因子，對于臨床上治療卵巢癌具有重要意義。硫化氫(H2S)廣泛分布于心血管、內臟和神經系統等組織〔1〕。研究顯示，內源性或外源性 H2S 能抑制腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡〔2～4〕，但其具體機制尚不清楚。研究發現〔5〕p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路的激活可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，而H2S可通過p38MAPK信號通路調節細胞增殖與凋亡。本課題組觀察H2S對人卵巢癌細胞增殖與凋亡的影響，并探討p38MAPK 信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人卵巢癌SKOV3細胞株(購自中科院上海細胞庫)。磷酸鹽緩沖液(PBS，上海生工)、碘化丙啶(Sigma公司)、NaHS(Sigma公司)、SB203580(德國Merck公司)、RPMI1640培養基(Invitrogen公司)，無支原體胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)、RNA酶(上海生工生物公司),AnnexinV/PI雙染試劑盒(Invitrogen公司)、四甲基偶氮唑藍MTT(Sigma公司)。

1.2儀器與設備 細胞培養箱(美國Thermo公司)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、流式細胞儀(德國Partec公司)、酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3試驗方法

1.3.1細胞培養 人卵巢癌SKOV3細胞復蘇后用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養，當細胞生長至80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶(含0.04%)消化細胞,按1∶4傳代繼續培養，細胞傳代周期穩定后即可用于實驗。

1.3.2實驗分組 SKOV3細胞計數后接種于培養板中，培養至細胞完全貼壁，去除培養基，無血清RPMI1640同步化24 h后，分為正常對照組，NaHS(0.01 mol/L)組，SB203580(0.1 mol/L)組，NaHS聯合SB203580組，正常對照組加入同體積的含10%FBS的RPMI1640培養基, 在5%CO2、37℃飽和濕度條件下干預培養48 h。

1.3.3MTT法檢測各組人卵巢癌SKOV3細胞增殖情況 SKOV3細胞，接種于96孔板內(以5×104個/ml)，200 μl/孔，待細胞完全貼壁后，加入無血清RPMI1640同步化24 h，然后按照實驗分組干預培養48 h，每個實驗組設3個復孔，各組結束干預前4 h,每孔分別加入20 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml),繼續避光培養4 h,棄上清，加入DMSO 150 ml/孔，室溫避光振蕩10 min，使結晶溶解，酶標儀測定各孔吸光度值(A490)。每次實驗均設無細胞對照作為空白調零組,以上實驗重復3次，并按下列公式計算細胞抑制率：抑制率(IR)=(A對照組值-A實驗組值)/(A對照組值)×100%。

1.3.4流式細胞術檢測各組人卵巢癌SKOV3細胞周期分布情況 SKOV3細胞接種于6孔板內(5×105個/ml)，2 ml/孔，待細胞完全貼壁后，用無血清RPMI1640同步化24 h后，按照實驗分組干預培養48 h，每個實驗組設3個復孔，48 h后消化收集細胞，用預先凍存的70%冰乙醇重懸細胞，吹打混勻，4℃固定過夜，過夜后離心去除乙醇，PBS 洗滌3遍，再用500 μl PBS 重懸細胞，加入 RNAseA,使其終濃度為250 μg/ml,于37℃孵育30 min,然后加入5 μl碘化丙啶染液,37℃避光保存 30 min ，上機檢測。實驗重復3次，并按以下公式計算系膜細胞增殖指數(PI)=S期和G2/M期細胞比例之和/G1期、S期和G2/M期細胞比例之和。

1.3.5流式細胞術檢測各組人卵巢癌SKOV3細胞凋亡情況 收集對數期人卵巢癌SKOV3細胞，以5×105個/ml接種于6孔板內，2 ml/孔，待細胞完全貼壁后，無血清RPMI1640同步化24 h后，按照實驗分組干預培養48 h，每個實驗組設3個復孔，48 h后收集細胞，嚴格按照AnnexinV/PI 雙染法凋亡試劑盒說明書操作，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，上述實驗重復3次。

1.4統計學分析 采用 SPSS20.0 統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組人卵巢癌細胞增殖情況(MTT法) 與正常對照組比較，經藥物干預處理48 h后NaHS組、SB203580組、NaHS聯合SB203580組人SKOV3細胞IR均明顯升高，差異有統計學意義(均P<0.01)。NaHS組與SB203580組人SKOV3細胞IR差異無統計學意義(P>0.05)，而NaHS聯合SB203580組人SKOV3細胞IR較NaHS組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。而與SB203580組比較，NaHS聯合SB203580組人SKOV3細胞抑制率亦明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 MTT法檢測各組干預48 h后對人卵巢癌細胞增殖的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與NaHS組比較：2)P<0.01；與SB203580組比較：3)P<0.01

2.2各組人卵巢癌SKOV3細胞周期分布情況 各組經藥物干預48 h后，NaHS組、SB203580組、NaHS聯合SB203580組G0/G1期細胞比例均較正常對照組明顯增加，S期細胞比例均較正常對照組明顯減少(均P<0.01)。與NaHS組比較，SB203580組各細胞周期時相分布與差異無統計學意義(均P>0.05),NaHS聯合SB203580組G0/G1期細胞顯著增加，S期細胞顯著減少(均P<0.01)。NaHS聯合SB203580組G0/G1期細胞比例較SB203580組顯著增加，S期細胞比例較SB203580組顯著減少(均P<0.01)。見表2。

表2 各組人卵巢癌SKOV3細胞周期分布情況

2.3各組人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的情況 與正常對照組〔(2.77±0.75)%〕比較, NaHS組〔(7.14±0.56)%〕、SB203580組〔(6.52±0.63)%〕、NaHS聯合SB203580組細胞凋亡率〔(10.54±2.08)%〕均顯著增加(均P<0.01)。與NaHS組比較，SB203580組細胞凋亡率無顯著增加或降低(P>0.05),NaHS聯合SB203580組細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)。NaHS聯合SB203580組細胞凋亡率較SB203580組亦顯著增加(P<0.01)。

3 討 論

卵巢癌因其發病隱匿，治愈困難而成為病死率最高的婦科惡性腫瘤。雖然目前手術及放化療等傳統治療手段不斷改進,但其總5年生存率仍<30%。因此，尋找能夠抑制或消滅卵巢癌細胞的藥物或因子，對臨床上治療卵巢癌具有重要的意義。 在哺乳動物細胞中H2S經胱硫醚裂解酶、胱硫醚β合成酶和半胱氨酸轉移酶等催化產生〔6〕。其在體內以H2S氣體和NaHS形式存在。Yan等〔7〕研究發現，低劑量NaHS(30～50 μmol/L)可減少細胞內氧自由基的生成，提高細胞生存率，而高濃度NaHS(1 mmol/L)能夠抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。Abrahamsen等〔8〕研究表明，H2S可以啟動凋亡機制誘導細胞死亡。本研究表明NaHS能誘導人卵巢癌的凋亡。 p38MAPK信號通路活化可以抑制多種細胞凋亡、促進細胞周期及細胞增殖，在細胞增殖與凋亡中起重要作用。Keuling等〔9〕用SB203580特異性阻斷P38MAPK通路能夠增強ABT-737誘導的黑色素瘤細胞凋亡。本研究表明p38MAPK信號通路可能參與了人卵巢癌細胞增殖的調控，當此通路被抑制后，人卵巢癌細胞的增殖亦被顯著抑制。且SB203580可協同NaHS抑制卵巢癌細胞的增殖，兩種藥物具有協同作用。因此，我們推斷，p38MAPK信號通路被阻斷時，NaHS抑制卵巢癌細胞增殖的作用被激活，協同NaHS對促進卵巢癌細胞凋亡的作用共同延緩卵巢癌的發展。