干擾素γ對星形膠質細胞中JAK-STAT細胞信號通路的激活作用

韓 浩 宣麗穎 白冬松 宋葆華 寶魯爾

(內蒙古民族大學醫學院，內蒙古 通遼 028005)

多發性硬化(MS)是以中樞神經系統白質炎性脫髓鞘病變為主要特點的自身免疫病，發病群體以中青年居多，但老年病例也較為常見。星形膠質細胞是MS病理變化中重要的靶細胞，常受累及的細胞分布于腦室周圍白質、脊髓、腦干和小腦等〔1〕。該病以病灶多發性和病程的時間多發性為主要特點。目前，MS治療手段較為局限，相關研究顯示干擾素(IFN)γ對于控制青年及老年MS的進展有著重要作用〔2〕。其中，IFNγ對星形膠質細胞JAK-STAT細胞信號通路的調節作用機制值得深入研究。本研究擬通過檢測干擾素調節因子(IRF)1及NLRC5來探討IFNγ促進星形膠質細胞中JAK-STAT細胞信號通路的激活作用。

1 材料與方法

1.1星形膠質細胞株培養及IFNγ的作用 人星形膠質細胞株購置于齊氏生物科技公司，細胞培養采用人神經星形膠質細胞培養試劑盒(Human Brain Prima CellTM：Normal Nerve Astrocytes Cells Cat No.3-0505)進行，所有操作按照試劑盒說明書進行。星形膠質細胞培養于37℃5%CO2培養箱。獲得足夠的細胞后用EDTA消化細胞，并將細胞濃度調整在3× 104/cm2。實驗組加入IFNγ至終濃度為250 IU/ml，空白對照組加入磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2Western印跡 離心獲得實驗組及空白對照組的檢測星形膠質細胞，進行檢測。細胞樣品先加入細胞裂解液RIPA裂解。然后將兩組獲得的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，進而將電泳結果轉膜到聚偏氟二乙烯(PVDF)膜。轉膜后加入封閉液在室溫下封閉60 min。4℃下，分別加入多克隆山羊抗人的IRF1及NLRC5的IgG一抗(RD公司，1∶200稀釋)孵育60 min。二抗加入稀釋好的辣根過氧化物酶標記的小鼠抗山羊的IgG孵育60 min，加入洗滌液5～10 min洗滌3次。內參照物采用β-actin。使用BeyoECL Plus(P0018)檢測蛋白，顯影成像。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

Western印跡結果顯示，終濃度為250 IU/ml IFNγ刺激體外培養的星形膠質細胞株與未加入IFNγ刺激的空白對照組相比，IRF1及NLRC5的水平顯著提高(P<0.05)，見表1，由此可見，IFNγ對星形膠質細胞JAK-STAT細胞信號通路的IRF1及NLRC5的有潛在的調節作用。

表1 Western印跡檢測兩組IRF1、NLRC5表達比較

與空白對照組比較：1)P<0.05

3 討 論

IRF1是一種核轉錄因子(NF)〔3〕。NLRC5蛋白分子表達于細胞質也是一種重要的模式識別受體(PRRs)，參與抑制炎癥反應和抗病毒反應〔4〕。二者均是JAK-STAT細胞信號通路的重要信號。NLRC5作為NF-κB和Ⅰ型IFN途徑的關鍵抑制分子，NLRC5能有效調控免疫細胞的活性。本研究顯示，IFNγ可以促進星形膠質細胞中JAK-STAT細胞信號通路的IRF1及NLRC5的表達，提示這兩個關鍵蛋白可能參與IFNγ對MS的治療過程。星形膠質細胞JAK1/STAT3細胞信號通路已經被證實在炎癥及出血性疾病中活化，從而在中樞神經系統疾病中被廣泛關注〔5〕。

JAK-STAT信號傳導的經典模式的優點在于其簡單性，因為細胞核中的JAK激活的STAT負責特定的基因激活。許多配體包括生長因子和激素使用相同的STAT轉錄因子〔6〕。但在細胞、組織和器官水平上發揮不同功能。本研究證實復雜的IFN信號與類固醇激素(SH)/類固醇受體(SR)信號傳導具有相似性，都有JAK-STAT信號傳導的經典模式的激活。IFN信號傳導都涉及復合配體，特異性激活相關基因的啟動子，活化的JAK和活化的STAT。它們可能都通過參與特異性基因激活和表觀遺傳重塑，從而改變MS的進程〔7〕。受體細胞內結構域在結合IFN的C末端中起重要作用，這是我們進一步研究的基礎。因此，IFN信號傳導的研究提供了對這種信號傳導的特異性和MS發展和治療機制的深入了解。

包括在MS動物模型和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的研究，JAK/STAT途徑還參與許多細胞因子信號傳導，并且對于免疫應答的發展，調節和終止是關鍵的靶點〔8〕。 所以，JAK/STAT途徑的調節對自身免疫和神經炎癥疾病具有重要的病理學意義。參與MS/EAE的許多細胞因子，包括IL-6，IL-12，IL-23，IFNγ和GM-CSF，通過JAK/STAT途徑誘導免疫應答。因此，在IFNγ研究的基礎上，靶向JAK對治療神經的自身免疫性炎癥已經顯示了非常廣闊的前景〔9〕。AZD1480處理通過阻止免疫細胞進入大腦，抑制Th1和Th17細胞分化，使骨髓細胞失活，抑制大腦中的STAT活化及減少促炎癥的表達，進而控制膠質細胞糖蛋白誘導的經典和非典型脊髓炎模型的病情轉歸。用AZD1480抑制JAK/STAT途徑在MS的多個臨床前模型中具有臨床功效，表明JAK/STAT途徑作為神經炎癥疾病的靶標可行性〔10〕。

MS及EAE動物模型的特征是局灶性炎癥浸潤到中樞神經系統，脫髓鞘病變，軸突損傷及激活免疫細胞和損傷神經元和少突膠質細胞的大量細胞因子的產生，包括IL-12，IL-6，IL-17，IL-21，IL-23，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和IFNγ。JAK/STAT信號通路介導這些細胞因子的生物活性，并且對免疫應答的發展和調節至關重要。JAK/STAT途徑在MS/EAE中異常激活，因為細胞因子過量產生，負調節因子如細胞因子信號蛋白抑制因子的表達缺失。除了IFNγ外，特定的JAK/STAT抑制劑已經用于許多MS的臨床前模型中，并且證明了對疾病的臨床過程和先天性和適應性免疫應答的減弱的有益作用。此外，其他藥物如他汀類，醋酸格拉替雷，拉喹莫德和富馬酸鹽具有有益效果，都有潛在的抑制JAK/STAT途徑的作用〔11〕。

CK2是一種高度保守和多效的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可促進許多促存活和促炎癥信號通路，包括PI3K/Akt/mTOR和JAK/STAT。CK2特異性地抑制小鼠和人Th17細胞分化，同時促進Foxp3+調節性T細胞(Tregs)的產生。Th17/Treg軸和Th17細胞的成熟是許多自身免疫性疾病(包括MS)的發病機制的主要促成因素。相關結果表明CK2是Th17/Treg軸和Th17細胞成熟的調節因子，并且表明CK2可以靶向治療Th17細胞驅動的自身免疫疾病〔12～14〕。miR-141和miR-200a可能是通過誘導Th17細胞分化和抑制向Treg細胞分化而在MS癥狀進展中的關鍵miRNA〔15〕。這些miRNA可能抑制Th17細胞分化的負調節因子，從而促進其分化。進一步研究IFNγ對這些miRNA的調節將會更深入的解釋IFNγ對MS的治療機制。總之，本研究結果及相關研究進展提示IFNγ對JAK-STAT細胞信號通路，以及相關miRNA及Th17/Treg的調節，可能成為未來利用IFNγ及其他免疫療法治療多發性硬化等自身免疫性疾病的有效的分子靶點。