花生紅衣中原花青素A1的分離鑒定及其對丙烯酰胺的抑制效果

趙 莉，盧 凱，王小紅，劉 睿*

（華中農業大學食品科技學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

熱加工能賦予食品誘人的風味和色澤，是一種重要的食品加工技術，但隨著檢測技術的進步，越來越多的新生有害物質在熱加工食品中被檢測出來，主要有丙烯酰胺、呋喃、羥甲基糠醛[1]、多環芳烴和雜環胺。研究表明油炸薯條、薯片等富含淀粉質碳水化合物的高溫加工食物中含有高含量的丙烯酰胺[1]，因其具有致畸性、致癌性、神經系統毒性和生殖毒性而引起人們對熱加工食品中包括丙烯酰胺在內的新生污染物的高度關注[2-3]。而如何篩選到高效的丙烯酰胺抑制劑添加到食品加工中從而減少食品熱加工過程中丙烯酰胺的產生一直是人們關注的焦點。

已有研究表明，酸化劑、氨基酸和蛋白質均可作為丙烯酰胺抑制劑[4]。檸檬酸在土豆和谷物食品體系中對丙烯酰胺的抑制率為23%[5]，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺可以使天冬酰胺-葡萄糖模型中丙烯酰胺含量降低57%[6]。近年來，包括原花青素在內的天然產物對丙烯酰胺抑制作用的研究被廣泛報道，如綠茶、肉桂、牛至等提取物能顯著抑制油炸土豆片中丙烯酰胺的產生[7-8]，香豆酸也具有類似的效果[9]。作為植物多酚中典型代表之一，黃烷醇及其衍生物對丙烯酰胺的抑制效果明顯優于黃酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷醇及其衍生物[10]。研究也證實兒茶素、表兒茶素這些黃烷醇類化合物抑制丙烯酰胺產生的效果優于槲皮素、沒食子酸等[11]，這表明黃烷醇類多酚——原花青素可能是一種更值得關注的丙烯酰胺抑制劑。已有研究發現葡萄籽原花青素在化學模擬體系中能顯著抑制丙烯酰胺的形成并且在添加量為0.5%時，抑制率可達58.4%[12]；蘋果原花青素粗提物在低濃度條件下對丙烯酰胺有明顯抑制作用[13]；蓮原花青素提取物在添加質量濃度為0.1 mg/mL、荔枝原花青素提取物在添加質量濃度為0.5 mg/mL時，丙烯酰胺的生成量均顯著減少[14]；花生紅衣原花青素（peanut skin procyanidins，PSP）在化學模擬體系和食品體系中對丙烯酰胺均有良好的抑制效果[15]。然而上述有關原花青素抑制丙烯酰胺效果的研究主要是以原花青素粗提物或混合物為研究材料而展開，重點關注單一的低聚體原花青素對丙烯酰胺抑制效果卻鮮有報道。

花生在中國是一種重要的油料作物，種植廣泛，其種皮即花生紅衣中含有豐富的原花青素，且以A型原花青素為主[16]，但是利用率很低[17]。因此本研究以花生紅衣為原料，制備并鑒定其中一種原花青素的結構，并探究該原花青素在天冬酰胺-葡萄糖化學模擬體系和炸薯條食品體系中對丙烯酰胺生成的抑制效果，以期為提高花生紅衣的利用率以及開發一種高效抑制食品熱加工過程中丙烯酰胺產生的食品添加劑提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生產于遼寧地區，品種為白沙；速凍薯條 山東綠潤食品有限公司；花生油 山東魯花集團有限公司。

原花青素A1（≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；丙烯酰胺（≥99%） 美國Sigma-Aldrich試劑公司；甲醇、乙腈（色譜級） 美國Thermo Fisher Scientific公司；L-天冬酰胺一水合物（純度99%）上海麥克林生化科技有限公司；D（+）-無水葡萄糖、甲醇、甲酸、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、正己烷（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RE52CS-1旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；KQ-100DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AL 204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YZ-1531-8友田多功能油炸鍋 廣東容聲電器股份有限公司；2695型高效液相色譜儀、Oasis HLB（200 mg，30 μm） 美國Waters公司；Hypercarb色譜柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）、Hypercarb保護柱（10 mm×2 mm） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；核磁共振光譜儀（600 MHz） 德國Bruker儀器公司；Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 6520液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用儀、ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×9.4 mm，5 μm） 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 花生紅衣中原花青素單體的分離制備

參考陳洋[18]的方法，以花生紅衣為原料，采用70%乙醇溶液進行熱提取90 min，通過AB-8大孔樹脂以40%乙醇溶液進行純化得到高純度的原花青素混合物粉末，然后將粉末通過Toyopearl HW-40（S）凝膠色譜柱進行分離，得到用于分離原花青素純品的目標級分記為PSP-4。采用制備型高效液相色譜分離PSP-4得到目標原花青素純品記為PSP-4-1。

反相-高效液相色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×9.4 mm，5 μm）；流動相A為0.13%甲酸溶液，流動相B為乙腈；流速3 mL/min；進樣量1 mL；檢測波長280 nm；梯度洗脫：0 min，15% B；15 min，15% B；30 min，45% B；35 min，15% B。

1.3.2 PSP-4-1的液相色譜-四極桿飛行時間質譜及核磁分析

用甲醇分別配制質量濃度為1.0 mg/mL的目標原花青素純品和原花青素A1對照品，分別通過0.22 μm濾膜過濾得到樣液，待進樣分析。

液相色譜-四極桿飛行時間質譜條件：Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.13%甲酸溶液，流動相B為乙腈；流速0.8 mL/min；進樣量5 μL；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；梯度洗脫：0 min，15% B；15 min，15% B；30 min，45% B；5 min，15% B。

質譜條件：電噴霧離子源，負離子模式；毛細管電壓3 500 V；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速8 L/min；噴霧壓力45 psi；質量掃描范圍m/z 100～900。

一維核磁共振采用Bruker Avance III HD 600 MHz核磁共振儀鑒定，氘代甲醇作溶劑。

1.3.3 丙烯酰胺的高效液相色譜測定

參考周婷[15]的分析方法。Hypercarb色譜柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）；Hypercarb保護柱（10 mm×2 mm）；檢測波長205 nm；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；流速0.6 mL/min；流動相為超純水；運行時間20 min。

1.3.4 丙烯酰胺標準曲線的繪制

將丙烯酰胺標準品配制成1.0 mg/mL標準溶液，采用稀釋法分別用超純水配制成0.5、1.0、5、10、20、30 μg/mL的標準液，采用1.3.3節方法，進行高效液相色譜分析。以丙烯酰胺標準品的質量濃度為橫坐標（X），相應的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到線性回歸方程為y=131 935x+35 560（R2=0.999 9），線性范圍在0.5～30 μg/mL之間。

1.3.5 模擬化學體系中丙烯酰胺抑制效果測定

參考周婷[15]的方法。稱一定量的天冬酰胺與葡萄糖，溶解在超純水中，制成丙烯酰胺反應液。用超純水將原花青素A1配制成質量濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/mL的溶液。移取1.0 mL反應液加入10 mL耐高溫的螺口試管中，實驗組加入100 μL已配制好的不同質量濃度的原花青素A1溶液，空白對照添加超純水。180 ℃油浴加熱30 min，反應后加入超純水定容至3 mL。取1.5 mL反應樣液于離心管中，分別加入carrez I和carrez II，混勻；5 000 r/min離心15 min。吸取上清液通過固相萃取柱，加入3 mL超純水洗脫，收集洗脫液過0.22 μm濾膜，通過1.3.3節建立的高效液相色譜法進行分析。通過1.3.4節繪制的標準曲線計算丙烯酰胺含量，并按下式計算原花青素A1對丙烯酰胺的抑制率。每組實驗重復4 次。

式中：M0為空白對照組中丙烯酰胺質量/μg；Mn為實驗組中丙烯酰胺質量/μg。

1.3.6 炸薯條食品體系中丙烯酰胺抑制效果測定

參考Qi Yajing等[19]方法，并稍作修改。溫水洗去薯條上的油脂，瀝干。采用超純水分別配制0.01、0.03、0.1、0.3 mg/mL的原花青素A1浸漬液，將薯條浸漬在不同質量濃度原花青素A1浸漬液中15 min，為實驗組；空白組浸漬在水溶液中；取出后將多余水分用濾紙擦干。薯條在175 ℃油炸6 min后，瀝干薯條殘余油分，并冷卻。稱取15 g炸薯條樣品粉碎，用正己烷脫脂30 min，棄去油層；重復脫脂1 次。樣品脫脂后，加入100 mL超純水超聲提取30 min；重復2 次，合并提取液。提取液在5 000 r/min離心20 min后，棄去正己烷層；再次向離心管中加入carrez I和carrez II，混勻；5 000 r/min離心20 min以沉淀蛋白。吸取處理后的提取液990 μL，并加入質量濃度為1 mg/mL的丙烯酰胺10 μL，通過固相萃取柱，加入3 mL超純水洗脫，收集洗脫液過0.22 μm濾膜，通過1.3.3節建立的高效液相色譜法進行分析。計算同1.3.5節。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 17.0軟件和Origin 9.1軟件進行數據處理，結果以表示，采用Duncan’s多重比較法進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 PSP-4-1的液相色譜-四極桿飛行時間質譜分析

圖1 以原花青素A1（a）為對照的PSP-4-1（b）的液相色譜-四極桿飛行時間質譜分析色譜圖Fig. 1 Q-TOF-LC/MS chromatogram of procyanidin A1 (a) and PSP-4-1 (b)

如圖1所示，PSP-4-1的保留時間為10.6 min，與原花青素A1的保留時間相對應。對圖1中原花青素A1和PSP-4-1進行一級質譜和二級質譜分析，結果如圖2所示。

圖2 原花青素A1（a）和PSP-4-1（b）的一級和二級質譜圖Fig. 2 Mass and MS2 chromatogram of procyanidin A1 (a) and PSP-4-1 (b)

由圖2b1可以看出，負離子模式下，在保留時間為10.6 min時出現m/z 575.117 8的準分子離子峰，其是原花青素組成單元（兒茶素和/或表兒茶素）由C4～C8或者C4～C6相連并在C2和C7或C2與C5之間形成C—O—C鍵的原花青素二聚體（即A型原花青素）在電噴霧離子源負離子模式下失去1個H而形成的分子離子質荷比，相對分子質量為576.117 8，分子式為C30H24O12。A型聚合體原花青素常發生RDA（Retro-Diels-Alder）裂解，即原花青素的C環，失去1個中性的C8H8O3，因此出現了m/z 423.072 6碎片[20]。A型二聚體可能會發生聚合，m/z 863.678 9是兩分子A型二聚體聚合后，在負離子模式下，失去1個H并發生quinone methide fission (QM) cleavage分子間斷裂（m/z減少290）產生的[21]。由圖2b2可知，PSP-4-1的二級碎片離子分別為m/z 539.099 0、407.078 1、285.040 8，其中m/z 539.099 0是分子離子脫去兩分子的H2O（m/z減少36）產生的，m/z 407.078 1是分子離子發生RDA裂解（m/z減少152）同時再脫去一分子的H2O產生的，m/z 285.040 8是分子離子發生quinone methide fi ssion (QM) cleavage分子間斷裂（m/z減少290）產生的。PSP-4-1中的分子離子斷裂及碎片符合A型原花青素二聚體裂解規律[22-23]。綜上，可以推斷制備后得到的PSP-4-1為A型原花青素二聚體。且與圖2a對比發現，其與原花青素A1的裂解信息基本一致，由此可初步推斷制備得到的PSP-4-1可能為原花青素A1。但由于原花青素的同分異構體種類很多，因此通過核磁共振進一步確定其結構。

2.2 PSP-4-1核磁鑒定結構

表1 化合物PSP-4-1的氫譜和碳譜數據Table 1 1H and 13C NMR data of PSP-4-1 (methanol-d4)

如表1所示，1H NMR氫譜數據顯示δ 2.57（1H，dd，J=16.44 Hz，J=8.22 Hz），2.94（1H，dd，J=16.44 Hz，J=5.58 Hz）為典型的原花青素H4信號，并且將PSP-4-1的1H NMR和13C NMR數據與參考文獻[20,24-25]對比，確定PSP-4-1為原花青素A1，其具體結構如圖3所示。

圖3 原花青素A1結構Fig. 3 Structure of procyanidin A1

2.3 原花青素A1在天冬酰胺-葡萄糖化學體系中對丙烯酰胺的抑制效果

從圖4可以看出，在天冬酰胺-葡萄糖化學體系中，原花青素A1對丙烯酰胺的生成有一定的抑制作用，這與Qi Yajing等[19]報道的結果一致。并且結果顯示丙烯酰胺抑制率與原花青素A1存在一定的質量濃度效應關系，在0.001～0.05 mg/mL質量濃度范圍內，隨著質量濃度的增大，抑制率增加；并且當質量濃度在0.05 mg/mL時，原花青素A1對丙烯酰胺的抑制率達到最大，為（58.10±3.86）%；但當在0.05～0.5 mg/mL質量濃度范圍內時，抑制率在逐漸下降。

圖4 化學體系中丙烯酰胺的抑制率與原花青素A1添加質量濃度之間的關系Fig. 4 Relationship between inhibition percentage of acrylamide formation and procyanidin A1 concentration in chemical model system (n = 4)

在化學體系中多酚類化合物可能與羰基和二羰基反應從而抑制丙烯酰胺的形成，如表兒茶素能與化學模擬體系中還原糖的C2、C3、C4直接反應，即表兒茶素A環上的C6、C8通過親電芳香取代與活性羰基形成共價鍵，從而抑制丙烯酰胺產生[26]。柚皮素結構中A環上的C6、C8與3-氧丙酰胺醛基結合，減少3-氨基丙酰胺（丙烯酰胺生成過程中重要的前體物質）的產生，從而抑制丙烯酰胺的形成[27]。原花青素在化學體系中可以顯著抑制丙烯酰胺的形成，其抑制機制可能也與此相關。但關于原花青素抑制丙烯酰胺的作用機制現在尚未闡明，還需進一步研究。

2.4 原花青素A1在炸薯條食品體系中對丙烯酰胺的抑制效果

圖5 食品體系中丙烯酰胺的抑制率與原花青素A1添加質量濃度之間的關系Fig. 5 Relationship between inhibition percentage of acrylamide formation and procyanidin A1 concentration in French fries (n = 4)

從圖5可以看出，在食品體系中，丙烯酰胺抑制率與原花青素A1也存在一定的質量濃度效應關系，在0.01～0.3 mg/mL質量濃度范圍內，隨著質量濃度的增加抑制率增加并達到最大值，當濃度進一步增大時，抑制率逐漸下降。并且當質量濃度在0.03 mg/mL時，原花青素A1對丙烯酰胺的抑制率達到最大，為（57.16±2.61）%，此質量濃度條件下對丙烯酰胺的抑制率與其他質量濃度條件下的抑制率比較，均存在顯著性差異（P＜0.05）。

相關研究發現，在化學體系中，P S P-4質量濃度在0.5 mg/mL時對丙烯酰胺抑制效果最佳，為（42.06±1.02）%[15]，而在本研究中，PSP-4-1即原花青素A1在0.05 mg/mL時已達到最大抑制率（58.10±3.86）%。同樣地，在食品體系中，PSP-4質量濃度也在0.5 mg/mL時對丙烯酰胺抑制效果最佳，為（46.13±1.56）%，而原花青素A1在0.03 mg/mL已達到最佳抑制率（57.16±2.61）%。即無論是在化學體系下，還是在食品體系下，原花青素A1對丙烯酰胺的抑制效果達到最佳時的質量濃度低于混合物PSP-4，但其最大抑制率卻高于混合物PSP-4對丙烯酰胺的最大抑制率。這一結果說明經純化分離得到的原花青素A1對于丙烯酰胺的抑制效果優于混合物，這對于開發高效的丙烯酰胺抑制劑及開發原花青素A1具有積極意義。

在食品體系中，油脂氧化能產生大量的丙烯醛，丙烯醛氧化形成丙烯酸可以與氨反應產生丙烯酰胺，而研究表明多酚，包括原花青素可以作為油脂氧化鏈式反應的斷裂劑[28]，可能會抑制油脂氧化產生丙烯醛，從而抑制丙烯酰胺的產生。由此可以推測原花青素A1抑制食品體系中丙烯酰胺的形成可能與其抑制油脂氧化有關。

大量研究表明多酚的濃度與其對丙烯酰胺的抑制效果間存在非線性量效關系，如竹葉抗氧化物在較低濃度條件下，對丙烯酰胺呈現正相關，而在較高濃度條件下，呈現負相關[29]。蘋果原花青素在低濃度條件下對丙烯酰胺抑制效果明顯高于高濃度蘋果原花青素抑制效果[13]。Budryn等[30]探究綠咖啡提取物（主要成分是黃酮和酚酸）對食品體系中丙烯酰胺產生的影響效果時發現，低濃度的綠咖啡提取物抑制丙烯酰胺的形成，而在高濃度時卻促進丙烯酰胺的形成。Qi Yajing等[19]研究發現不同聚合度的原花青素在食品體系中對丙烯酰胺的抑制效果均呈現先增大后減小的趨勢。而在本研究中，不管是化學模擬體還是食品體系也得到了類似的結果。這可能是由于丙烯酰胺的形成和消除是一個動態的過程，在加熱過程中，氧自由基可能誘導丙烯酰胺發生聚合，而多酚由于其結構中的酚羥基具有清除氧自由基的能力，影響了丙烯酰胺的聚合，導致部分多酚在較高濃度時對丙烯酰胺抑制效果下降的原因。

3 結 論

本研究以花生紅衣為原料，采用凝膠色譜分離并結合反相高效液相色譜分離制備得到一種原花青素，通過與對照品比較、液相色譜-四極桿飛行時間質譜分析及核磁共振技術鑒定其結構為表兒茶素-（2β→O→7,4β→8）-兒茶素（原花青素A1）。

研究原花青素A1在化學模擬體系及炸薯條食品體系中對丙烯酰胺生成的影響，原花青素A1在2 種體系中對丙烯酰胺的形成均有抑制作用，并且在實驗選定質量濃度范圍內，原花青素A1對丙烯酰胺的抑制均呈現先增大后減小的趨勢。在化學模擬體系中，當原花青素A1的質量濃度在0.05 mg/mL時，對丙烯酰胺的抑制率達到最大，為（58.10±3.86）%；食品體系中，其質量濃度在0.03 mg/mL時，對丙烯酰胺的抑制率達到最大，為（57.16±2.61）%。這一研究對于開發一種高效、經濟的丙烯酰胺抑制劑具有指導意義。