微波輔助提取工藝對大豆種皮水溶性多糖-蛋白乳狀液乳化活性及表面電位的影響

范宏亮，趙玲玲，李 君，王勝男，朱丹實，劉 暢，韓金蓮，劉 賀,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.錦州億和豆業有限公司，遼寧 錦州 121016；3.錦州市產品質量監督檢驗所，遼寧 錦州 121013；4.盤錦宋大房食品有限公司，遼寧 盤錦 124000）

食品乳狀液體系分水包油（oil in water，O/W）和油包水（water in oil，W/O）兩種類型[1]。蛋白質、油脂、多糖是食品乳狀液體系中重要的3類生物大分子，是影響食品穩定性和質構的主要因素，分子間的相互作用，體系的乳化活性、乳化穩定性并非這3種分子之間作用的簡單加和[2-5]。O/W型乳狀液能夠通過絮凝、聚集、交聯、分層等形式破壞整個體系的穩定性，因此在制備O/W型乳狀液時需要加入表面活性劑，Mcclements等提出乳狀液的穩定性可以通過添加多糖，形成“雙層”或者“逐層”涂覆微滴從而改善乳狀液的物理特性[6-7]。多糖可降低油-水界面張力，因而也降低了乳化時能量的消耗，有利于體系的乳化和乳狀液的穩定[8]。多糖對乳狀液穩定性的影響取決于蛋白質與多糖之間相互作用，這種作用大部分是共價鍵作用，部分非共價鍵作用（靜電作用、疏水相互作用、氫鍵作用等）使多糖分子與蛋白分子在乳狀液分子層界面上排列緊密，乳狀液相對穩定[9-10]。向大豆分離蛋白乳狀液中添加多糖，形成大豆分離蛋白與多糖共價復合物，其中多糖的引入是對蛋白質的一種改性或者是對其功能性質的強化，可提高蛋白質的乳化能力、乳化穩定性[11]。有報道稱蛋白質與多糖的共價結合提高蛋白質的乳化特性，增加乳狀液的黏度，乳狀液的黏度僅取決于油體積分數，而不是油的種類[12-13]。

大豆種皮中含有豐富的果膠類多糖[14]，大豆多糖的提取屬于固液浸提過程，大豆種皮多糖與其近似[15]。國內外關于大豆種皮多糖研究目前開展了關于提取分離和初步理化性質分析方面工作，如Kalapatuy等[16]研究得知大豆種皮中半乳糖醛酸質量分數為60%～85%，劉賀等[17-22]研究發現微波輔助提取可顯著提升多糖提取率，并研究了多糖的單糖組成等性質，所提多糖中總糖質量分數達82.36%，從所帶電荷來看，一般包括中性糖組成及酸性糖組成，相對分子質量為2.293×105～4.094×105Da，為闡明大豆果膠類多糖結構與功能性質的關系奠定理論基礎。但目前關于大豆種皮多糖-蛋白乳狀液乳化方面的研究報道較少，課題組前期研究發現，提取工藝對多糖性質影響較大，因此本實驗重點考察微波輔助提取工藝對以大豆種皮多糖為乳化穩定劑的多糖-蛋白乳狀液性質的影響規律，以期為工業化生產大豆種皮多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆種皮 錦州大豆皮經銷公司；乙醇（分析純）天津市天力化學試劑有限公司；草酸銨（分析純）天津市津東天正精細化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；NANO-ZS90 ZS-90粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；Turbiscan LAB多重光散射儀 法國Formulaction公司；OA21002型精密電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；L-535R型離心機、SL-250A型離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；RE-3000型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；FJ-200型高速分散均質機 上海標本模型廠；SH-3型雙顯恒溫加熱磁力攪拌器 北京金紫光科技發展有限公司；SL-250A高速多功能粉碎機 浙江省永康市松青五金廠；DHG-9055A型電熱鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；AR224CN型電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；PHS-3C型精密pH計上海雷磁儀器廠；WD800G型微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆種皮水溶性多糖的制備

大豆種皮水溶性多糖的提取采用課題組前期研究方法[17]，提取劑為草酸銨溶液，微波輔助萃取工藝參數的設置按照響應面試驗設計方案。

準備材料（大豆皮）→干燥粉碎→加入乙醇溶液脫色、攪拌→過濾→濾渣干燥→取干燥后濾渣→加入萃取劑（草酸銨）溶液→微波處理→離心→取上清液→真空濃縮→調pH值→乙醇沉淀→干燥→大豆種皮多糖

1.3.2 大豆種皮水溶性多糖-蛋白乳狀液的制備

配制50 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，取40 mL，加入10 mL的大豆油。利用高速剪切機于10 000 r/min剪切1 min，制成50 mL的初級乳狀液。將大豆種皮多糖配制成60 mg/mL的水溶液，與初級乳狀液以1∶1（V/V）混合，并利用高速剪切機于10 000 r/min剪切1 min，最終使乳狀液包含10%油、2%大豆分離蛋白、3%大豆種皮多糖[21]，再加入0.02%疊氮化鈉用來抑制微生物的生長，制成的乳狀液于4 ℃貯存[23]。

1.3.3 響應面試驗

參考劉賀等[17]微波輔助提取大豆種皮果膠工藝，結合本課題組前期單因素試驗結果的基礎，篩選出顯著影響乳狀液性質的大豆種皮多糖提取工藝的因素進行Box-Behnken試驗設計[24]，以所提取多糖制備乳狀液的乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）、Zeta電位絕對值為指標，確定乳狀液相關性質最佳的工藝參數。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.4 乳狀液EAI的測定

用微量取樣器取出底部的乳狀液5 0 μ L，用0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉溶液稀釋到一定倍數后放入比色皿中，以相同的十二烷基硫酸鈉溶液作參比液，立即測定其在500 nm波長處的吸光度A。根據趙國華等[25]的方法進行簡化，乳化活性用EAI表示，見式（1）[26]：

1.3.5 乳狀液Zeta電位的測定

利用NANO ZS90激光粒度分布儀測定乳狀液的Zeta電位，取1 mL稀釋10 倍的乳狀液于樣品池中，在20 ℃條件下進行Zeta電位測定[27]。根據布朗運動理論計算電泳遷移（μep），見式（2）：

式中：v為液滴速率/（m/s）；E代表外加電場/V。

應用Henry關系計算出Zeta電位，見式（3）：

式中：ε為液體介電常數；η為黏度/（Pa·s）；ζ為Zeta電位值/mV；f（ka）為Henry函數。

1.3.6 多重光散射儀對乳狀液穩定性分析

采用Turbiscan LAB多重光散射儀對乳狀液進行掃描，可得到不同響應值隨時間變化的曲線[28]。穩定性動力學指數（turbiscan stability index，TSI）是通過累計樣品所有高度處前后兩次掃描測量的光強度變化值，得到樣品穩定性的評價指標，見式（4）[29-32]。對乳狀液進行掃描，間隔1 min，共掃描20 min，進行TSI對比。

式中：h為掃描點高度/mm；H為樣品總高度/mm；|scani（h）-scani-1（h）|為h高度處相鄰兩次掃描點光強度變化絕對值。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

以EAI、Zeta電位絕對值為指標，進行3因素3水平設計，篩選影響響應值的主要因素。如表2所示，不同條件下EAI為37.26～46.15 m2/g，Zeta電位絕對值在22.5～36.8 mV之間，均優于大豆分離蛋白空白對照乳狀液（EAI為16.31 m2/g，Zeta電位絕對值為21.5 mV）。根據表2的試驗結果，進行方差分析，結果見表3、4。EAI數學回歸模型為EAI=45.32+1.26A+1.03B-0.56C-0.15AB-0.035AC+1.58BC+0.95A2-2.14B2-2.29C2。

由表3可知，回歸模型與響應值之間的關系具有極顯著性（P＜0.01），失擬項具有不顯著性（P＞0.05）。由表3可以看出，各因素中一次項A、B均極顯著，C顯著，其次是二次項A2顯著，BC、B2、C2極顯著，模型極顯著。說明各因素對EAI的影響不是簡單的線性關系。失擬項不顯著，說明此模型對試驗的擬合度較好，試驗誤差較小，故可用此方程預測不同微波作用條件對大豆種皮多糖乳狀液乳化活性的影響。由表2可知，添加大豆種皮多糖的乳狀液EAI值增加，微波功率480 W、微波時間35 min、料液比1∶20工藝下提取的大豆種皮多糖制備的乳狀液EAI為46.15 m2/g，空白對照大豆分離蛋白乳狀液EAI為16.31 m2/g，說明添加大豆種皮多糖后，乳狀液乳化活性明顯提高。過高微波功率作用使大豆種皮多糖構象改變，所獲得的酸性糖組分和中性糖組分含量及分子質量發生變化[21]，造成乳化性的降低，由于微波條件不同，導致大豆種皮多糖中總糖含量發生變化，具體結構差異有待后續深入研究。相比于大豆分離蛋白乳狀液，蛋白質與多糖非共價鍵的連接改善了蛋白質的界面性質[33]，增加了乳狀液乳化活性。在此研究中，乳狀液中的大豆分離蛋白與大豆種皮多糖之間能夠很好地進行交融，大豆種皮多糖溶液帶負電，大豆種皮多糖的增加略減少了大豆分離蛋白在乳狀液中氮溶解指數，乳化活性有所下降，乳化穩定性顯著提高[34]。在此方面，對于乳狀液中分子間靜電相互作用，在乳狀液分子層界面上，多糖分子在蛋白分子外圍排列緊密形成空間位阻[12]，因此影響了乳狀液EAI。各因素對EAI影響主次順序為A（微波功率）＞B（微波時間）＞C（料液比）。試驗模型的相關系數R2值為0.972 5，其矯正決定系數值為0.937 2，表示該模型的擬合度較好，試驗誤差相對較小，其回歸方程可以很好地描述各因素與響應值之間的關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

表3 EAI方差分析Table 3 Analysis of variance for EAI

表4 乳狀液Zeta電位絕對值方差分析Table 4 Analysis of variance for Zeta potential absolute value

對Zeta電位絕對值回歸模型Y及其系數進行顯著性檢驗，方差分析見表4。Zeta電位絕對值回歸模型為Y=33.34+2.4A+3.09B+1.88C+0.1AB-1.4AC+0.075BC-4.43A2-1.86B2-1.06C2。

由表4可以看出，各因素中一次項A、B均極顯著，C顯著，其次是二次項A2極顯著，模型極顯著，失擬項不顯著，說明此模型對試驗的擬合度較好，試驗誤差較小，故可用此方程預測不同微波作用條件對大豆種皮多糖乳狀液Zeta電位的影響。通過對比Zeta電位的相關數據，結合原理，根據課題組前期對大豆種皮多糖的單糖組成及分析[22]，可能原因是大豆種皮多糖的中性側鏈產生的空間位阻穩定乳狀液，多糖連接到蛋白質表面，部分結構可以伸入兩相中形成有效的乳狀液保護層，降低界面張力，增強液滴間靜電排斥或空間位阻[35]，而粒子間的靜電排斥作用只起到次要的輔助穩定作用。乳狀液絮凝主要受界面層上發生的吸引和排斥作用影響，增強液滴間的靜電可提高乳狀液抗絮凝能力，由實驗結果可知，添加大豆種皮多糖后乳狀液液滴的Zeta電位絕對值增大，電荷量不斷增加，說明添加大豆種皮多糖后，使蛋白顆粒間的斥力增大，從而提高乳狀液的穩定性。得到各因素對Zeta電位絕對值重要性依次排序為B（微波時間）＞A（微波功率）＞C（料液比）。試驗模型的相關系數R2值為0.927 0，其校正決定系數j值為0.829 1。

2.2 響應面分析與最優條件的確定

圖1 各因素單獨作用對指標影響的趨勢圖Fig. 1 Effect of individual factors on the response variables

通過圖1可以看出，EAI隨著微波功率的增加，EAI逐漸增大，而隨著提取時間的延長呈現先增大后減小現象，料液比的影響具有同樣規律。這說明提取出來的大豆種皮多糖的結構隨著微波功率變化而變化[36]，即微波作用條件的不同，導致了提取的大豆種皮多糖自身結構的變化[37-43]，可能是由于多糖表面張力受到破壞，從而再次與蛋白質乳狀液結合后，不能更好地發揮出乳化活性劑的作用，導致EAI發生變化。如圖1所示，各個單因素對Zeta電位的影響中，Zeta電位絕對值隨著微波功率的增大，先增大后減小，隨著微波時間的延長，曲線上升趨勢由明顯變為舒緩，料液比的影響也具有同樣規律。Zeta電位絕對值的大小關乎著乳狀液是否絮凝和聚結，因為乳狀液穩定性受界面電荷的影響，Zeta電位絕對值越大，說明顆粒間斥力越大，乳狀液越不容易聚結，因而也就越穩定。微波作用條件的不同，可能導致大豆種皮多糖結構以及表面電荷的影響[44]。在食品乳狀液中，多糖作為一種表面活性劑，對整個乳狀液的穩定性起決定性作用。提取條件不同導致多糖表面電荷不同，從而影響電荷穩定，乳狀液液滴的有效電荷與它的實際電荷不符。當帶電荷偏離液滴表面時，它們的表面會出現帶電不平衡現象，從而影響乳狀液穩定性[45]。

通過圖2可以看出，影響因素AB、AC、BC間存在兩兩作用，其中微波時間、料液比之間的交互作用明顯，形狀更接近于橢圓形。結合表3可知，雖然AB、AC交互作用不顯著，但是三者間對EAI的影響存在規律。與EAI相比，Zeta電位絕對值的兩兩因素交互作用，明顯優于EAI，尤其微波功率與微波時間的交互作用更強，圖形接近橢圓形，并且結合圖1可知，單因素對Zeta電位絕對值的影響非常顯著，這與表4方差分析結果相符。

利用Design-Expert V 8.0.6軟件對試驗數據進一步分析，并對擬合的回歸方程進行計算，預測最佳提取工藝為微波功率567 W、微波時間42.92 min、料液比1∶20.96（g/mL）。為考察試驗結果的準確性與可行性，將驗證工藝調整為微波功率640 W、微波時間43 min、料液比1∶21（g/mL）。此條件下的乳狀液EAI為45.65 m2/g，Zeta電位絕對值為34.16 mV，接近預測值，但是并不是最佳的試驗條件，因此根據試驗結果，選取最佳乳化活性、穩定性較好的大豆種皮多糖提取工藝為微波功率480 W、微波時間35 min、料液比1∶20（g/mL）。此結果可能是由于根據實際情況所選取的工藝條件與驗證實驗實際相差較大，但是通過本次實驗，得到了微波輔助提取工藝對大豆種皮水溶性多糖乳狀液性質的影響規律，驗證了外界因素對蛋白與多糖復合物乳化性能的影響[46]。為后續深層次剖析其乳化相關性提供了參考依據。

根據實驗結果，選取最佳乳化活性、乳化穩定性的大豆種皮多糖提取工藝為微波功率480 W、微波時間35 min、料液比1∶20（g/mL），此條件下得到的最優多糖-蛋白乳狀液EAI為46.15 m2/g，Zeta電位絕對值為34.3 mV。

2.3 多重光散射對不同提取條件TSI影響規律

圖3 不同提取條件所制備乳狀液穩定性TSI值的影響Fig. 3 Stability TSI values of emulsions containing polysaccharides prepared under different extraction conditions

TSI穩定系數越小、斜率越小，表明乳狀液越穩定[47]。如圖3所示，添加大豆種皮多糖的乳狀液TSI曲線斜率均小于大豆分離蛋白空白對照乳狀液，20 min后，TSI整體小于1.3，大豆分離蛋白空白乳狀液TSI大于7。說明在相同時間內，添加大豆種皮多糖的乳狀液穩定性較好。從斜率變化趨勢來看，添加大豆種皮多糖的乳狀液TSI變化趨于平穩，乳狀液逐漸趨于穩定[48]。第15組乳狀液的穩定性最好，第14組其次。根據響應面設計方案，第13～17組為相同工藝條件下的平行實驗，此工藝條件下乳狀液穩定性相對較好。結合響應面分析獲得的最佳工藝參數，并通過EAI、Zeta電位絕對值的分析，結果能夠相互印證。

3 結 論

采用微波提取法提取大豆種皮多糖，通過響應面分析可知，3 個因素對大豆種皮多糖-蛋白乳狀液乳化性影響順序從大到小依次為微波功率＞微波時間＞料液比。經響應面試驗，得出乳狀液穩定性最優的大豆種皮多糖的提取條件為微波功率480 W、微波時間35 min、料液比1∶20（g/mL）。在此條件下乳狀液EAI為46.15 m2/g，Zeta電位絕對值34.3 mV。多重光散射實驗結果驗證了此結論。本研究內容為工業化生產高乳化穩定性大豆種皮多糖提供參考。