苜蓿冰結構蛋白對速凍餃子皮質地的影響

曲 敏，耿浩源，孫 玥，田 野，楊麗媛,2，陳鳳蓮

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱勞動技師學院，黑龍江 哈爾濱 150025）

冰結構蛋白（ice structuring proteins，ISPs），又稱為抗凍蛋白、不凍蛋白或熱滯蛋白，是由動物、植物、昆蟲和微生物等為抵御外界低溫而產生的蛋白質[1-2]，具有一定的熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA），非依數性降低冰點，與冰進行特異性結合等特性，具有控制冰晶生長、修飾冰晶形態、抑制冰晶重結晶[3-4]等作用。現已知的ISPs主要來源于植物、海洋魚類、昆蟲和微生物。植物ISPs的THA不高，現已知的ISPs主要來源于植物。由于具有抗凍保護作用，ISPs作為一種新型食品添加劑，近年來在食品行業的應用受到了廣泛的關注，其中以植物ISPs最容易被消費者和食品生產企業所接受。Payne等[5]發現將肉浸泡在ISPs溶液中，可以顯著減少由凍藏產生的冰晶數量；美國DNAP公司發現將ISPs添加到牛奶和冰淇淋中可以有效地消除冰渣，改善產品的風味和質量[6]；李玲玲等[7]研究了冬小麥ISPs對濕面筋蛋白凍藏穩定性的影響。隨著冷凍行業的發展和人們生活需求的增加，速凍水餃在人們日常飲食中占據的地位越來越高[8]。雖然速凍水餃的技術和模式在不斷進步，但仍存在著速凍后水餃表皮開裂，水煮時口感黏爛，湯汁渾濁，餃子皮顏色加深等質量問題[9-10]。隨著凍藏時間的延長和運輸過程中溫度波動而造成的凍融循環會導致水餃凍裂和結坨等現象，因而影響速凍水餃的貯存和銷售[11]。提高速凍水餃質量、改善口感、降低成本已成為各個企業共同關注的焦點。研究發現，選擇合適的添加劑有利于減少速凍水餃的凍裂率、提高其蒸煮質量、改善口感風味[12]。

苜蓿（Medicago sativa L.）是多年生豆科植物，也稱為金花菜或草頭，江浙等地將其作為菜蔬食用。苜蓿的蛋白質含量高，鮮品中蛋白質平均質量分數達18%以上。苜蓿產量高，素有“牧草之王”美稱，且耐寒，在極端嚴寒條件下（-45 ℃）的返青率仍高達90%。本研究通過從苜蓿中提取苜蓿冰結構蛋白（alfalfa ice structure proteins，AISPs），確定其分子質量和THA，將其添加到速凍餃子皮并對餃子進行多次凍融循環實驗，觀察餃子皮外觀凍裂情況，檢測餃子皮持水性和質構品質的變化，以及檢測AISPs對冷凍濕面筋表征結構的影響。為拓寬AISPs在速凍水餃行業中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“肇東”紫花苜蓿 黑龍江省蓬勃牧草有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司；餃子粉 河北金沙河面業集團；豬肉、芹菜、調料 市售。

1.2 儀器與設備

XL-08多功能粉碎機 永康市帥通工具有限公司；FDU-1200型冷凍干燥機 日本東京理化公司；Z366高速大容量臺式離心機 德國哈默公司；SU8010掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；TA-XT2i型質構儀 英國SMS公司；DSC4000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀美國PerkinElmer科技有限公司；BS224S型電子分析天平北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AISPs的提取

由于ISPs具有與冰進行特異性結合的特點，根據本課題組改良的冰結合磷酸緩沖溶液法[13-14]從苜蓿干草中提取AISPs。將苜蓿干草粉碎，過80 目篩，以料液比1∶20（g/mL）與磷酸緩沖溶液（0.63 mmol/L、pH 7.7）混合。磁力攪拌2 h后以8 000 r/min離心15 min，取上清液。上清液中加入直徑為10 mm的冰球，每100 mL上清液加50 個冰球，置于-18 ℃冰箱冷凍2.5 min，使冰球與AISPs發生結合后，取出冰球，冰球融化的液體即為AISPs溶液。經濃縮，冷凍干燥制成AISPs凍干粉備用。

1.3.2 AISPs的THA檢測

利用DSC儀測定THA，參考文獻[15-16]的方法并進行改進。取5 μL 20 mg/mL樣品注入坩堝底部，以空坩堝為參比，以1 ℃/min的速率將溫度降至-20 ℃，平衡10 min，使樣品結冰固化且使系統穩定，再以同樣的速率升溫至10 ℃，從熱流-溫度/時間曲線上可得到樣品熔點Tm及熔融焓ΔHm（即吸熱峰面積）。以同樣的速率再降溫至-20 ℃，平衡10 min，再以1 ℃/min左右升溫至保留溫度Th，平衡10 min，再降溫至-20 ℃。記錄降溫后部分融化狀態再次全部凍結產生的重結冰溫度T0和結冰焓ΔHf，改變Th，重復實驗，由DSC曲線得到不同停留溫度條件下體系的冰晶含量及樣品的THA。THA與冰核含量（φ）按公式（1）、（2）計算：

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）測定AISPs分子質量

采用SDS-PAGE法[17]對AISPs進行電泳實驗。分離膠為12%，濃縮膠為4%，電泳開始時電壓恒定為80 V，樣品完全進入分離膠時將電壓調節為120 V。

1.3.4 速凍水餃的制備及質地檢測

1.3.4.1 速凍餃子的制備及凍融處理

制備豬肉芹菜餡水餃。參考林瑩等[18]的方法制作餃子皮，參照李雪琴等[11]的方法制作豬肉芹菜餃子餡。

將AISPs凍干粉溶于水，與餃子粉充分混合，制成AISPs質量分數分別為0%、0.1%、0.3%、0.5%的餃子皮（以面粉為基準）。用4 種不同AISPs添加量的餃子皮包成家常豬肉芹菜餡水餃，將包好的餃子放入-50 ℃低溫冰箱速凍20 min，再移入-18 ℃冰箱中凍藏。1 周后取出于室溫（25 ℃）條件下完全解凍，此為1 個凍融周期，將以上速凍餃子樣品分別處理0、1、2、3、4、5 個凍融周期。

1.3.4.2 速凍餃子皮持水性的測定

取解凍后的餃子去餡，將餃子皮在高速離心機中10 000 r/min離心15 min，倒掉離心出來的液體，根據公式（3）計算餃子皮持水率，用以評估餃子皮的持水性。

式中：M1為離心前餃子皮質量/g；M0為離心后餃子皮質量/g。

1.3.4.3 速凍餃子皮質構特性的測定

餃子解凍后去餡，取3 cm×3 cm完整餃子皮平整的放在載物臺上，調整位置至探頭正下方，檢測生餃子皮的質構特性。

取500 mL水燒開，將需要測試的餃子放入沸騰的水中，待再次沸騰時開始計時，到最佳時間后立刻撈出，放入涼水中冷卻1 min。用濾紙將餃子表面吸干，然后去餡取3 cm×3 cm完整餃子皮平整的放在載物臺上，調整位置至探頭正下方，檢測熟餃子皮的質構特性。

質構特性測試條件[19-21]：采用P35柱形探頭，在TPA模式下分別設定測前速率1.00 mm/s，測試速率0.80 mm/s，測后速率0.80 mm/s，下壓距離4.00 mm，時間3.00 s，引發力5.00 g，應變位移70.00%，引發距離2.00 mm。目標模式為應變位移，引發類型為自動（力）。

1.3.4.4 觀察水餃表面的凍裂情況

將達到凍融周期的水餃從冰箱中取出，觀察速凍餃子皮表面的開裂情況，拍照記錄。

1.3.5 速凍餃子皮的SEM結構表征

將解凍后的速凍餃子皮樣品用刀片切成2 mm×5 mm的小片[22]，加入2.5%、pH 6.8的戊二醛固定并置于4 ℃冰箱中固定1.5 h以上。用0.1 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液沖洗2～3 次，每次10 min。然后分別用50%、70%、90%的乙醇溶液進行脫水各一次。每次10～15 min，無水乙醇脫水3 次，每次10～15 min。無水乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）溶液，純叔丁醇各一次，每次15 min。放入冷凍干燥儀干燥。將干燥樣品黏在樣品臺上，用鍍膜儀鍍上金屬膜，置于SEM下觀察樣品的結構。

2 結果與分析

2.1 AISPs的SDS-PAGE分析

圖1 AISPs的凝膠電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE pattern of AISPs

由圖1可知，AISPs的主條帶清晰，其分子質量約為52 kDa，在30～35 kDa處也有條帶。與沙冬青葉片中分離出的ISPs為40 kDa相比較[23]，分子質量稍高。另一條帶接近于胡蘿卜[24]和女貞葉[25]中分離出的分子質量為36 kDa的ISPs。

2.2 AISPs的THA檢測結果

表1 AISPs的THA檢測結果Table 1 THA values of AISPs

圖2 AISPs的熱流曲線Fig. 2 Heat fl ow curve of AISPs

通過表1與圖2中的THA可以看出，隨著停留溫度的降低，反復凍融并未對THA造成明顯影響，AISPs的THA均為0.54 ℃，低于女貞葉ISPs的0.678 ℃[25]高于沙冬青葉ISPs的0.46 ℃[26]。表明AISPs的THA良好。

2.3 AISPs對速凍餃子皮持水性的影響

水分遷移是影響速凍餃子皮品質的主要因素之一[27]，凍結過程中，餃子皮中的水發生結晶。其中的半結合水由于與高分子物質結合不緊密而發生遷移，不斷靠攏細小冰晶進而形成大冰晶，大冰晶會刺破面筋的網絡結構。隨著凍融次數的增加，面筋蛋白分子疏水基團暴露，降低了面筋蛋白的持水性，而大冰晶和重結晶會對面筋蛋白結構造成進一步的破壞，持水性也將進一步降低。因此，持水性間接反映了面筋蛋白內部網絡結構的均一性及其穩定性。從圖3可以看出，在冷凍過程中，速凍餃子皮的持水性在凍藏1 周時最高，之后隨著凍融周期的增加持水性呈下降趨勢，但添加AISPs餃子皮的持水性普遍好于對照，且隨著AISPs添加量的增加，其持水性增加。以AISPs添加量為0.5%時效果最好。說明在冷凍過程中，由于AISPs與冰的結合能力強，修飾冰晶形態能力強，AISPs能有效吸附鎖住餃子皮中的水分，阻止了大冰晶的形成，提高了速凍餃子皮的持水性。

圖3 AISPs對餃子皮持水率的影響Fig. 3 Effect of AISPs on water-holding capacity of dumpling wrappers

2.4 AISPs對生、熟餃子皮質構特性的影響

圖4 AISPs對生、熟餃子皮硬度（A）、黏性（B）、彈性（C）、咀嚼性（D）、膠著性（E）和黏聚性（F）的影響Fig. 4 Effect of AISPs on texture properties of cooked and raw dumpling wrappers

趙琳等[28]認為，不同品種間煮熟餃子皮的質構指標中如硬度、回復性、黏聚性、膠著性、咀嚼性等不同樣品間均呈極顯著差異，表明質構儀的測定指標均可反映餃子皮的質地結構差異，可作為評價餃子結構特性的客觀量化指標。

從圖4可以看出，隨著凍融周期的增加，速凍生餃子皮的硬度、咀嚼性整體上升，其中硬度指標中添加AISPs組低于對照，咀嚼性中添加組高于對照，膠著性不穩定；彈性、黏性整體下降，添加組均高于對照；黏聚性不穩定。以添加0.5% AISPs組的改變明顯。速凍餃子皮質構品質的變化是水分結晶和重結晶造成的，且隨著冰晶的變大，大冰晶會破壞面筋蛋白的網絡結構，面筋蛋白網絡結構的塌陷[29]，使硬度和咀嚼性升高；麥谷蛋白是數條亞基通過分子間—S—S—交聯形成的聚合物，為面制品提供彈性和黏性。多次的凍融循環使餃子皮面筋蛋白和麥谷蛋白質量下降導致餃子皮的彈性、黏性明顯下降；面筋蛋白網絡結構不穩定，不均一導致了黏聚性的下降；而黏聚性的不穩定也說明了內部結構的不穩定[30]。本研究結果基本反映了以上原理，符合冷凍貯藏環境對速凍餃子皮質地特性的影響規律。從添加AISPs的結果看，AISPs影響了速凍生餃子皮的硬度、彈性和黏性，改善了速凍餃子皮在凍藏過程中的質地。

李雪琴等[31]研究了速凍餃子皮煮后質構指標與感官評價指標的相關性，結果顯示，熟餃子皮的硬度、黏聚性、膠著性、咀嚼性與感官評價總分呈顯著正相關，與食味極顯著相關，彈性和黏性與感官評價總分不相關。從圖4可以看出，經過5 個周次的凍融循環后，添加AISPs熟餃子皮的硬度、黏聚性、膠著性、黏性、彈性和咀嚼性均高于對照，且以添加0.5% AISPs組的效果最顯著。說明添加AISPs很好地改善了速凍熟餃子皮的質地與感官特性。

通過比對，添加AISPs速凍餃子皮生、熟條件下的硬度、膠著性和黏聚性的影響不同，說明添加AISPs對于速凍餃子皮的部分質構特性和質地在生、熟階段產生的影響效果不同。因此，在檢測評價速凍餃子皮的質地特性時，應結合生、熟餃子皮的質構特性指標進行綜合評價。

低溫條件下產生的冰晶對餃子皮面筋蛋白網絡結構的破壞是不可逆的，冰晶越大破壞越大，這種結構的破壞影響了面筋蛋白內部的穩定性，進而影響水餃的口感和品質。而添加AISPs可以有效地修飾冰晶形態，抑制重結晶，提高面筋蛋白網絡結構的穩定性，對面筋蛋白和速凍餃子皮的質地起到了很好的抗凍保護作用。

2.5 餃子外觀開裂情況

圖5 5 個凍融周期餃子皮開裂情況Fig. 5 Cracking condition of dumpling skin after 5 freeze-thaw cycles

經檢查，凍融1～3 個周期的餃子除空白外皆無開裂；4 個凍融周期和5 個凍融周期的餃子開裂情況基本相同。從圖5可以看出，經過5 個凍融周期后，對照餃子皮有大裂縫、開裂程度大；添加0.1% AISPs的餃子皮裂紋較小；添加0.3% AISPs的餃子皮現細小、可見裂紋；

AISPs添加量為0.5%的餃子皮表面完整、無開裂。說明AISPs添加量為0.5%時對餃子皮凍裂保護最好。

2.6 速凍餃子皮的SEM結構表征

圖6 速凍餃子皮的SEM結構表征Fig. 6 Structural characterization of quick-frozen dumpling wrapper by SEM

通過SEM可以觀察到經過5 個凍融循環后，速凍餃子皮的微觀結構。從圖6A可以看出，面筋膜粗糙變薄，斷裂、不均勻，并出現不規則孔洞。孔洞變大且不規則、質地稀疏，面筋纖維塌陷，淀粉顆粒暴露較多，面筋蛋白網絡破壞嚴重；從圖6B可以看出，仍然有成片的面筋存在，面筋有少量斷裂，面筋孔洞大小、規則、面筋體系連接緊密等均較好，孔洞雖變大，但形態規則、質地較均勻，面筋纖維不塌陷，淀粉顆粒暴露較少，面筋蛋白網絡遭到破壞程度較小。說明，AISPs對凍融條件下的面筋蛋白網絡和淀粉顆粒具有良好的保護作用。速凍餃子皮的SEM結果佐證了在凍融過程中的開裂情況。

Gélinas等[32]的研究表明冰晶體的重結晶會導致蛋白質結構發生變化。Berglund等[33]發現凍藏會使面筋蛋白的網絡結構發生明顯的不連續、斷裂，導致這種現象的主要原因是冰晶體的增長。速凍餃子皮的開裂主要是由面粉中面筋蛋白的網絡結構被破壞引起的。由于溫度的波動造成的凍融循環，會使餃子皮里的面筋蛋白中的冰晶發生遷移，此時面筋蛋白網絡結構會受到擠壓，擠壓到一定程度網格中的冰晶會被釋放出來，釋放出來的冰晶會繼續對面筋網絡結構造成損傷，最終造成了整個面筋網絡結構的破壞和坍塌。隨著凍融次數的增加，面筋蛋白分子疏水基團暴露，降低了面筋蛋白的持水性，此時冰晶的重結晶會對面筋蛋白結構造成進一步的破壞。這種對面筋蛋白網絡結構的破壞，直接導致了速凍餃子外皮的開裂大小，面筋網絡結構變差，使餃子皮的彈性和抗膨脹力下降，因此在速凍和冷藏過程中容易開裂。

3 結 論

本研究采用冰結合磷酸緩沖溶液法，從苜蓿干草中提取制備AISPs，對其分子質量和THA進行鑒定，并添加于速凍餃子皮中，考察不同凍融周期的影響。得到結論如下：

AISPs的主要分子質量約為52 kDa，THA為0.54 ℃。速凍餃子皮的持水性隨著凍融周期的增加呈整體下降趨勢，而AISPs添加組的持水性隨添加量的增加而增加。添加AISPs對速凍餃子生、熟餃子皮的質構特性產生了影響，隨著凍融周期的增加，生餃子皮中，同對照組相比較添加組的硬度較低，咀嚼性較高，黏聚性不穩定；熟餃子皮中，硬度、咀嚼性、黏聚性都較對照增大。添加組中生、熟餃子皮的彈性和黏性均高于對照。其中以添加0.5% AISPs組的改變明顯。經過5 個凍融周期后，對照餃子皮的冷凍開裂程度大，AISPs添加組無明顯開裂，其中0.5%組的餃子皮表面完整、無開裂。速凍餃子皮的SEM結構表征顯示，添加AISPs能有效改善面筋蛋白的網絡結構和淀粉顆粒。

綜上，AISPs具有較好的抗凍活性，可以有效地防止速凍水餃內部面筋蛋白網絡結構被破壞，對其質構特性產生了一定的影響，降低了凍融過程中的開裂現象，對速凍水餃皮的質地具有很好的抗凍保護作用，且凍融次數越多效果越明顯。本實驗為AISPs作為一種新型食品添加劑，在速凍水餃及冷鏈面食品中的應用提供了基礎研究信息。