麥胚降血糖肽的分離純化及鑒定

顏 輝，張 琦，江明珠，朱勝虎，聶旭東，余永建，張佳鑫，賈俊強(qiáng)，熊 孟

（1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.江蘇恒順集團(tuán)有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212028）

小麥?zhǔn)鞘澜绶秶鷥?nèi)的主要糧食作物之一，2015年我國小麥的產(chǎn)量高達(dá)1.3億 t[1]。小麥胚芽是面粉加工過程中的副產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%左右[2]，具有很好的開發(fā)利用價(jià)值。近年來隨著胚芽油產(chǎn)量的不斷增加，如何高效利用的殘留物“脫脂麥胚”成為亟待解決的難題[3]。

隨著生活水平提高，人們攝入食物過多及運(yùn)動(dòng)減少，糖尿病的發(fā)生率逐漸增多。長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致心、腦、腎等重要器官的病變，重者威脅生命[4]。目前，臨床上多為II型糖尿病，其中α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類重要的降血糖藥物，它能抑制小腸內(nèi)多聚寡糖水解為單糖，導(dǎo)致單糖吸收量減少，從而實(shí)現(xiàn)降低血糖目的[5-6]。由于藥物的副作用較大，因此尋找新型α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

近年來，多肽類α-葡萄糖苷酶抑制劑的研發(fā)引起了人們的重視[7-11]，雜色蛤、山杏、絲素和蛋清蛋白經(jīng)過酶解產(chǎn)生的多肽有抑制α-葡萄糖苷酶活性，起到輔助降低血糖的作用。但上述這些蛋白存在來源少、成本高等缺點(diǎn)，難以滿足規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)需求。

前期研究發(fā)現(xiàn)，麥胚蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解所得多肽具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，這為工業(yè)化生產(chǎn)具有降血糖作用的功能性多肽提供了思路。本實(shí)驗(yàn)以α-葡萄糖苷酶活性抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立超濾、離子交換、凝膠阻排和反相高效液相色譜（reverse phasehigh performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離純化方法，并采用高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜（HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry，HPLC-ESI-MS）鑒定出多肽的結(jié)構(gòu)組成，闡明麥胚降血糖多肽發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)麥胚降血糖肽提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂麥胚粉 河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；對(duì)硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、4-氨基安替比林（均為分析純），葡萄糖氧化酶（酶活力≥180 U/mg） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；胰蛋白酶（1∶250，酶活力≥2 500 U/mg）、732型陽離子樹脂、DA201-C大孔吸附樹脂、711型陰離子交換樹脂 國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖凝膠（SephadexG-25和SephadexG-15型） 美國安瑪西亞公司；乙腈、三氟乙酸（均為色譜純） 美國Tedia天地試劑有限公司；ICR小鼠 江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證編號(hào)：NO.201600100）。

1.2 儀器與設(shè)備

LXQ型紫外檢測(cè)器 上海康華生化儀器制造廠；HL-2B液相色譜離子阱-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo公司；Pellicon型小型超濾系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制率檢測(cè)方法

參照Lee等[11]的方法檢測(cè)，肽得率參照文獻(xiàn)[12]方法。

1.3.2 麥胚蛋白的制備

采用酶法輔助的堿提酸沉提取麥胚蛋白[13]。100.0 g脫脂麥胚粉溶于1 000 mL蒸餾水中，1 mol/L Na2CO3溶液調(diào)pH 11，50 ℃間歇攪拌2 h，3 900 r/min離心15 min，取上清液，1 mol/L醋酸溶液調(diào)節(jié)pH 6.3，加α-淀粉酶（加酶量30 U/g），60 ℃水解1 h；1 mol/L醋酸溶液調(diào)pH 4.5，3 900 r/min離心15 min，取沉淀，冷凍干燥得麥胚蛋白。

1.3.3 麥胚降血糖多肽的制備

根據(jù)前期通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)獲得的最佳條件制備麥胚降糖多肽。取50 mL 0.8%的麥胚蛋白，用功率60 W、頻率65 kHz的超聲波，48 ℃超聲處理30 min，冷卻至37 ℃，加胰蛋白酶（加酶量25 000 U/g）酶解，1 mol/L Na2CO3溶液維持pH 8左右，17 min后沸水浴10 min滅酶，待用。檢測(cè)麥胚蛋白酶解前后對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.4 麥胚降血糖肽對(duì)糖尿病模型小鼠血糖的影響

利用四氧嘧啶建立II型糖尿病高血糖模型小鼠，給予降血糖多肽干預(yù)，評(píng)估麥胚降多肽的降血糖效果[14]。

1.3.4.1 糖尿病小鼠模型的建立

ICR小鼠購自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)環(huán)境1 周。分為4 組，每組6 只，雌雄各半，分別為正常組（A），模型組（B），正常+麥胚多肽干預(yù)組（C），模型+麥胚多肽干預(yù)組（D）。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h（不禁水），B、D組尾靜脈注射75 mg/kg 4%四氧嘧啶溶液（使用pH 4.5的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配）[15]，A、C組尾靜脈注射等量生理鹽水作為陰性對(duì)照。藥物注射完畢，使用4%的葡萄糖溶液作為飲用水，防止小鼠低血糖。C、D組使用超濾后分子質(zhì)量小于5 kDa多肽（3.24 mg/mL）灌胃給藥，劑量48.6 mg/（kg?d）。A、B組灌胃等量的生理鹽水，每間隔3 d取血檢測(cè)血糖水平。

1.3.4.2 麥胚多肽降血糖效果的評(píng)價(jià)

以餐后血糖、體質(zhì)量、采食量和飲水量作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)麥胚降血糖肽對(duì)糖尿病小鼠的效果。每隔1 周小鼠餐后1 h取血檢測(cè)血糖，稱體質(zhì)量，并記錄當(dāng)天的采食量和飲水量，共2 周。

1.3.5 活性跟蹤的分離純化[16]

1.3.5.1 超濾

將酶解液8 000 r/min離心25 min，取上清液，0.45 μm濾膜（Whatman）初濾后進(jìn)行超濾。設(shè)定溫度為25 ℃，進(jìn)口壓力為20 psi，出口壓力為10 psi，采用全回流的方式收集2 組分，分別為分子質(zhì)量大于5 kDa的組分I和分子質(zhì)量小于5 kDa的組分II。

1.3.5.2 離子交換吸附

選用DA201-C大孔吸附樹脂、732陽離子交換樹脂、711陰離子交換樹脂進(jìn)行離子交換吸附實(shí)驗(yàn)。

1）靜態(tài)吸附：稱取預(yù)處理過的樹脂4.0 g于錐形瓶中，加入分子質(zhì)量小于5 kDa的組分II（3.80 mg/mL）35 mL，室溫振蕩，每隔10 min取樣分析多肽含量，直至達(dá)到交換平衡，計(jì)算麥胚降血糖肽的吸附率。2）動(dòng)態(tài)吸附：準(zhǔn)確稱取已經(jīng)預(yù)處理過的2 種樹脂各2.0 g，裝入交換柱中，取分子質(zhì)量小于5 kDa的組分II（1.93 mg/mL），1.0 mL/min過柱，收集洗脫液，測(cè)定多肽濃度，計(jì)算不同時(shí)間內(nèi)樹脂對(duì)多肽的吸附率。3）吸附樹脂解吸：將動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)束的樹脂，蒸餾水洗至中性，用乙醇洗脫DA201-C大孔樹脂，用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.5%和2.5%）氨水洗脫732陽離子樹脂，流速都為1.0 mL/min，計(jì)算解吸率。4）732型陽離子交換樹脂純化多肽：將處理好的732型陽離子樹脂裝入1 cm×40 cm玻璃柱，平衡后將超濾所得分子質(zhì)量小于5 kDa的麥胚多肽II（1.93 mg/mL）上柱，流速1 mL/min，吸附完全后用蒸餾水1 mL/min沖洗，然后用最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)氨水洗脫，收集、濃縮洗脫峰，檢測(cè)多肽濃度，測(cè)定對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.5.3 凝膠分離純化

首先用SephadexG-25凝膠分離麥胚降血糖肽。預(yù)處理凝膠，裝柱（1 cm×40 cm），加入經(jīng)離子交換后的多肽（20.0 mg/mL），上樣量為凝膠床總體積的5%。蒸餾水洗脫，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，收集洗脫液。SephadexG-25分離后的高活性組分再用SephadexG-15凝膠分離純化，實(shí)驗(yàn)方法與本方法相同。

1.3.5.4 RP-HPLC分離

SephadexG-15分離純化所得到高活性部分進(jìn)行RP-HPLC分離制備，并分峰收集。RP-HPLC條件：Agilent C18反相色譜分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，孔徑80 ?，比表面積：180 m2/g），流動(dòng)相A 0.05%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，流動(dòng)相B乙腈（含有0.05% TFA），流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（90∶10，V/V）。流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL（3.0 mg/mL）。多次重復(fù)，收集、合并分離峰，測(cè)定各峰的抑制活性，選取其中活性最高的組分進(jìn)行HPLC-ESI-MS分析。

1.3.6 多肽結(jié)構(gòu)鑒定

HPLC-ESI-MS進(jìn)行多肽的結(jié)構(gòu)鑒定。液相色譜條件：Thermo LXQ液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent C18反相色譜分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），洗脫流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL（1.0 mg/mL），流動(dòng)相A：超純水（含有0.05% TFA），流動(dòng)相B：乙腈（含有0.05% TFA），流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（90∶10，V/V）。質(zhì)譜條件： ESI正電荷模式，m/z范圍50～2 000，MS/MS級(jí)數(shù)2 級(jí)，離子方式ESI+。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥胚多肽的制備

麥胚蛋白對(duì)α-葡萄糖苷酶無抑制活性，經(jīng)胰蛋白酶酶解，得到具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽，IC50為10.98 mg/mL。

2.2 麥胚降血糖肽實(shí)驗(yàn)高血糖模型小鼠的治療效果

糖尿病動(dòng)物血液中葡萄糖含量高，導(dǎo)致原尿滲透壓升高，腎小管重吸收減小，尿液排出增加，同時(shí)伴隨葡萄糖、無機(jī)鹽、營養(yǎng)物質(zhì)的排出，導(dǎo)致糖尿病動(dòng)物的飲水量顯著增加[17]；糖尿病患者體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)的分解增多，個(gè)體攝食量增加以補(bǔ)償營養(yǎng)流失[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中，造模組的實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)明顯的多尿、多飲、多食以及體質(zhì)量下降的情況，此外還出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、體毛松散等現(xiàn)象，表示造模成功。

2.2.1 麥胚多肽對(duì)糖尿病小鼠飲水量的影響

圖1 麥胚多肽對(duì)糖尿病小鼠飲水量的影響Fig. 1 Effect of hypoglycemic peptides on water consumption in diabetic mice

如圖1所示，造模后B、D組的小鼠飲水量和A組相比差異極顯著（P＜0.01），表明造模后小鼠飲水量急劇增加，糖尿病的多飲癥狀明顯[20]；灌胃麥胚多肽2 周后，D組與B組比較差異極顯著（P＜0.01），表明麥胚蛋白多肽可以緩解小鼠飲水量增多的癥狀，D組和A組比較有顯著差異（P＜0.01），提示麥胚蛋白治療小鼠的多飲癥狀尚未恢復(fù)到正常水平。A組與C組比較無顯著性差異，說明麥胚蛋白對(duì)正常小鼠的飲水量無影響作用。

2.2.2 麥胚多肽對(duì)糖尿病小鼠采食量的影響

圖2 麥胚多肽對(duì)糖尿病小鼠采食量的影響Fig. 2 Effect of hypoglycemic peptides on feed intake in diabetic mice

如圖2所示，造模后B、D組和A組比較，采食量差異極顯著（P＜0.01），表明造模后小鼠采食量大量增加。經(jīng)麥胚治療2 周后，D組采食量與B組差異極顯著（P＜0.01），提示麥胚多肽能夠緩解小鼠采食量增多的癥狀；D組與A組比較有極顯著差異（P＜0.01），表明經(jīng)麥胚多肽治療的糖尿病小鼠的采食量尚未恢復(fù)到正常水平。C組和A組之間無顯著差異（P＞0.05），提示麥胚多肽對(duì)正常小鼠采食量無影響。

2.2.3 麥胚多肽對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

圖3 麥胚多肽對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響Fig. 3 Effect of hypoglycemic peptides on body mass in diabetic mice

如圖3所示，造模后，小鼠體質(zhì)量無顯著性差異。隨著時(shí)間的推移，正常小鼠（A、C組）體質(zhì)量上升，B、D組小鼠體質(zhì)量無增加。經(jīng)麥胚治療2 周后，D組小鼠體質(zhì)量與正常組A比較有極顯著差異（P＜0.01），表明D組小鼠體質(zhì)量未能夠恢復(fù)到正常水平。A組與C組比較無顯著性差異（P＞0.05），提示麥胚多肽對(duì)正常小鼠的體質(zhì)量無影響。B組與D組小鼠比較無顯著性差異（P＞0.05），表示經(jīng)過15 d的麥胚多肽治療，體質(zhì)量未有明顯變化。

2.2.4 麥胚多肽對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖濃度的影響

如圖4所示，B、D組與A組比較差異極顯著（P＜0.01），表明糖尿病模型小鼠的血糖高于正常小鼠，與Mckillop等[21]報(bào)道相近。經(jīng)麥胚降血糖肽治療2 周后，D組與B組比較有極顯著差異（P＜0.01），表明麥胚多肽對(duì)餐后血糖有明顯降低作用；D組與A組比較有極顯著性差異（P＜0.01），表明尚未恢復(fù)到正常水平。A組與C組比較無顯著性差異（P＞0.05），提示麥胚多肽對(duì)正常小鼠的血糖無影響。

圖4 麥胚多肽對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響Fig. 4 Effect of hypoglycemic peptides on blood glucose in diabetic mice

通過以上的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，表明麥胚多肽能夠起到降低血糖的作用，治療2 周內(nèi)能夠部分緩解多飲、多食和高血糖癥狀，對(duì)體質(zhì)量無明顯影響，長(zhǎng)期效果需要更長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。

2.3 分離純化

2.3.1 超濾

麥胚酶解多肽經(jīng)過超濾后得到大于和小于5 kDa的兩個(gè)組分，大于5 kDa的組分得率67.7%，IC50為14.33 mg/mL；小于5 kDa組分的多肽得率為32.3%，IC50為1.60 mg/mL。由此可見，活性成分主要在分子質(zhì)量小于5 kDa組分中，對(duì)其進(jìn)一步的分離。超濾后所得低分子質(zhì)量組分的抑制率顯著高于高分子質(zhì)量組，原因在于對(duì)α-葡萄糖苷酶起抑制作用的主要物質(zhì)是小分子多肽，這與文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道制備其他功能性多肽制備的結(jié)果相似。

2.3.2 離子交換吸附

2.3.2.1 靜態(tài)吸附

圖5 3 種樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig. 5 Static adsorption curves of three resins for hypoglycemic peptides from wheat germ

分別使用732型陽離子交換樹脂、DA201-C大孔吸附樹脂和711型陰離子交換樹脂對(duì)小于5 kDa的麥胚降血糖多肽進(jìn)行靜態(tài)吸附，如圖5所示。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，711陰離子交換樹脂吸附率幾乎不變，且很低，表明對(duì)麥胚降血糖多肽的吸附作用很弱。732陽離子交換樹脂的吸附率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在60 min時(shí)達(dá)到最大值74.19%。DA201-C大孔吸附樹脂在110 min時(shí)達(dá)到最大71.34%。因此732陽離子交換樹脂達(dá)到最大值的速率較DA201-C大孔樹脂快速，單就靜態(tài)吸附率而言，732陽離子交換樹脂與DA201-C大孔吸附樹脂相似，因此采用這兩種樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2.2 動(dòng)態(tài)吸附

圖6 2 種樹脂對(duì)麥胚降血糖肽的動(dòng)態(tài)吸附Fig. 6 Dynamic adsorption curves of two resins for hypoglycemic peptides from wheat germ

732型陽離子交換樹脂和DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)小于5 kDa的麥胚降血糖多肽動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。在0～50 min之間吸附率不斷上升，50～70 min趨于平衡，DA201-C大孔樹脂最大吸附率為36.04%，732型陽離子樹脂最大吸附率為41.25%，因此732陽離子交換樹脂效果比較好，選用此樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2.3 樹脂解吸

在離子交換中，洗脫液中的pH值、離子強(qiáng)度會(huì)影響分離的效果。使用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氨水洗脫動(dòng)態(tài)吸附完全的732型陽離子交換樹脂，以確定最佳的離子強(qiáng)度。隨著氨水質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，洗脫率顯著上升，0.5%、1.5%和2.5%氨水的洗脫率分別為78.14%、86.81%和98.13%，表明2.5%氨水基本可將吸附的多肽完全洗脫，因此選擇2.5%的氨水作為732型陽離子交換樹脂洗脫劑。

2.3.2.4 732型陽離子交換樹脂動(dòng)態(tài)分離

圖7 離子交換洗脫圖Fig. 7 Dynamic evaluation curve of 732 cation exchange resin

由圖7可見，0～200 min是上樣峰C-I，200～500 min是洗脫峰C-II。因此，經(jīng)過732型陽離子交換樹脂分離之后得到一個(gè)明顯峰C-II，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后測(cè)IC50為0.30 mg/mL，對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性比離子交換前（IC50為1.60 mg/mL）有顯著提高，達(dá)到了純化效果。Fang Yuwen等[24]報(bào)道絲膠水解多肽，過DEAE-纖維素柱，NaCl溶液洗脫收集的組分，抑制活性顯著提高，IC50為41 μg/mL。

2.3.3 凝膠分離

圖8 SephadexG-25分離圖譜Fig. 8 Separation chromatogram on SephadexG-25

如圖8所示，分離得到2 個(gè)組分C-II-1、C-II-2，分別收集兩個(gè)多肽峰，測(cè)其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，C-II-2為高活性組分，IC50為0.16 mg/mL，因此，用葡聚糖凝膠SephadexG-15對(duì)組分C-II-2進(jìn)一步純化，結(jié)果見圖9。C-II-2經(jīng)SephadexG-15分離后得到2 個(gè)組分C-II-2.1和C-II-2.2。分別收集、濃縮，組分C-II-2.1為高活性組分，對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為0.13 mg/mL。

圖9 SephadexG-15分離圖譜Fig. 9 Separation chromatogram on SephadexG-15

2.3.4 RP-HPLC分離

圖10 C-II-2.1組分的RP-HPLC圖Fig. 10 RP-HPLC chromatogram of C-II-2.1

C-II-2.1組分經(jīng)RP-HPLC分析，結(jié)果如圖10所示，色譜圖中有8 個(gè)吸收峰，表示8 個(gè)（或組）多肽，命名為R1～R8，R1號(hào)峰所含多肽的IC50為0.098 mg/mL，其他組分測(cè)不出，由此可見R1號(hào)峰的活性最高；峰面積最大，提示組分含量也最大，因此，主要的降血糖肽在1號(hào)峰內(nèi)。

2.4 多肽結(jié)構(gòu)

質(zhì)譜分析法是一種基于質(zhì)荷比的分析方法，具有靈敏、準(zhǔn)確和快速等優(yōu)點(diǎn)。ESI-MS是一種鑒定微量多肽序列的有效工具[25]，常與液相色譜、氣相色譜等其他分離方法聯(lián)用。本實(shí)驗(yàn)中多次重復(fù)收集RP-HPLC分離的1號(hào)峰，使用HPLC-ESI-MS對(duì)麥胚降血糖多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)果如圖11所示，出現(xiàn)1 個(gè)豐度較高的離子m/z 274.45，因此此離子對(duì)應(yīng)的肽是最主要的物質(zhì)，對(duì)此離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜解析。

圖11 HPLC-ESI-MS聯(lián)用的部分MS圖譜Fig. 11 Mass spectrum

在ESI過程，分子因附加一個(gè)正電荷（H+）以離子[M+H]+的形式存在，通過磁場(chǎng)或電場(chǎng)根據(jù)m/z進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜（MS）鑒定，因此m/z為274.45的一級(jí)質(zhì)譜片段，按照實(shí)際m/z為273.45片段值多肽組成序列進(jìn)行分析。理論上多肽骨架斷裂形成a1、b1、c1、a2、b2、c2、x1、y1、z1、x2、y2、z2等不同離子片段，在多肽序列分析中常用的片段為b1、y2、b2、y1等離子片段[26]。

圖12 m/z 274.45的MS/MS二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 12 Tandem mass spectrum at m/z 274.45

如圖12所示，Thr-Gly-Pro的計(jì)算值b1為102.18、y2為171.13、b2為114.08、y1為159.23，其中4 個(gè)離子均可以在圖12中找到對(duì)應(yīng)碎片，因此m/z 274.45的序列可能為Thr-Gly-Pro。Gly-Thr-Pro的計(jì)算值y2為215.16、b2為114.08、y1為159.23，除了b1的58.05因儀器質(zhì)譜采集下限是65.00，因而無法判斷，其余離子均可以在質(zhì)譜圖12中找到，因此其三肽序列可能為Gly-Thr-Pro。同理也可得到Ser-Pro-Ala、Pro-Ser-Ala、Ile-Ala-Ala、Leu-Ala-Ala為其可能的多肽序列。

表1 麥胚降血糖多肽的組成及結(jié)構(gòu)Table 1 Structural identification of hypoglycemic peptides from wheat germ

不同的蛋白經(jīng)酶解后，產(chǎn)生的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽產(chǎn)物不同。Ren Yao等[27]從大麻種子蛋白酶解產(chǎn)物中分離鑒定出兩種多肽有α-葡萄糖苷酶抑制活性，分別是二肽Leu-Arg（287.2 Da）和五肽Pro-Leu-Met-Leu-Pro（568.4 Da）。Lee等[11]從絲繭酶解產(chǎn)物中鑒定出兩種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的三肽，分別為Gly-Glu-Tyr（mw367 Da） 和Gly-Tyr-Gly（mw295 Da）。Yu Zhipeng等[28]從白蛋白酶解產(chǎn)物中鑒定出一個(gè)五肽Lys-Leu-Pro-Gly-Phe（mw561.3 Da）。本實(shí)驗(yàn)中，通過HPLC-ESI-MS分析，麥胚降血糖多肽結(jié)果見表1，可能有7 種，其中二肽有1 種，三肽有6 種。雖然這7 種肽組成的混合有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但具體是哪一種發(fā)揮作用或哪幾種共同起作用并不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。此外，多肽除了可以抑制α-葡萄糖苷酶，還可能通過抑制氧化應(yīng)激[29-30]、二肽基肽酶-IV[31]等發(fā)揮作用，多肽也可調(diào)節(jié)脂酯代謝，這對(duì)糖尿病的防治也起到積極作用[32]。因此，闡明多肽的作用機(jī)理，對(duì)于開發(fā)功能性降血糖多肽有重要的意義。本研究獲得的酶解麥胚多肽在氨基酸組成與上述報(bào)道不同，因此是一種（或一組）新型的降血糖多肽。麥胚來源廣泛，采用酶解方法可以很容易規(guī)模化制備功能性降血糖肽，對(duì)于促進(jìn)麥胚的深加工、延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈有重要的促進(jìn)作用，同時(shí)也給糖尿病患者提供新型功能性降血糖食品。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，酶解麥胚多肽在體內(nèi)外均有降血糖活性。通過分離純化可以獲得高活性的麥胚降血糖肽，具體的工藝流程是超濾、732型陽離子交換樹脂進(jìn)行離子交換吸附、葡萄糖凝膠SephadexG-25和SephadexG-15分離。采用HPLC-ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，鑒定出7 種多肽，其中二肽有1 種，三肽有6 種。起降血糖作用的是一種多肽或復(fù)合多肽，需要進(jìn)一步深入研究。

本研究研究了高活性麥胚降血糖肽的制備工藝，鑒定了發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)于促進(jìn)麥胚資源的高效利用有重要意義，同時(shí)也給糖尿病患者帶來福音。