表達外源谷氨酸脫羧酶基因對重組乳酸乳球菌脅迫抗性的影響

陳 琪，張亞敏，趙 穎，梅 林，傅瑞燕

（1.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2.茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036）

乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）不僅有助于提高食品的營養價值、改善食品風味，而且具有特殊的生理活性和營養功能，在調節機體胃腸道正常菌群的平衡、提高食物消化率和生物價、控制內毒素、抑制腸道內腐敗菌生長繁殖和腐敗產物的產生等方面發揮重要的作用[1-3]，因此成為功能性食品開發的熱點。但是，乳酸乳球菌在工業生產過程中會面臨多種物理、化學方面的脅迫作用，包括酸脅迫、低溫脅迫、氧脅迫、滲透脅迫等，從而抑制其生長，影響生產效率[4]。如何通過代謝工程的手段提升乳酸乳球菌對外源脅迫的抵御能力，進而改善其工業生產性能，是當前迫切需要解決的問題。

γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）是一種普遍以自由態呈現的非蛋白質類氨基酸[5]，對真核生物和原核生物多具有廣泛的生理功能。GABA主要由L-谷氨酸經谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）脫羧產生。在大多數植物體內，當處于厭氧或者逆境條件下時，由于細胞內部的破壞，使得細胞質pH值下降，會激活GAD活性使得細胞通過脫羧反應將谷氨酸轉變成堿性更強的GABA，消耗胞內H+，產生ATP，當細胞質pH值恢復正常后，GAD的活性又會下降[6-9]。因而GABA支路成為植物中一條重要的防止或減輕逆境引起的細胞酸中毒途徑。

在乳酸乳球菌體內，由于糖類發酵過程中大量積累終產物有機酸，導致發酵體系的酸化，是其生長的本質特征[10]，因而降低胞內pH值是其抗酸脅迫的一種主要方式。除了通過F1F0-ATPase向胞外運輸H+以調控胞內pH值平衡之外，在酸性條件誘導下，還會啟動GAD系統、檸檬酸代謝系統和精氨酸脫亞胺酶系統[11-13]等降低胞質酸化程度，從而減少酸脅迫[14]。

本研究基于植物GABA代謝調控機制的研究基礎，利用食品級乳酸鏈球菌素（Nisin）控制的基因表達系統[15]，將源自茶樹的一條GAD基因與乳酸菌表達載體pNZ8148[16]連接后轉入L. lactis NZ9000中，利用Nisin進行誘導表達，以調控GAD在乳酸乳球菌中的表達時機[17-18]，研究高效表達GAD生產GABA的過程對于改良乳酸乳球菌菌株酸脅迫和冷凍脅迫抗性的影響，旨在為提高乳酸菌的抗脅迫能力及工業化生產GABA提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

L. lactis NZ9000、表達質粒載體pNZ8148 湖南長沙贏潤生物技術有限公司；Escherichia coli DH5α菌株由本實驗室保存。

1.1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、PrimerSTAR?Max DNA Polymerase、pMD19-T Vector、dNTPs、DL 2 000 DNA Marker、T4 DNA連接酶、限制性內切酶HindIII、NcoI日本TaKaRa公司；Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞、TransStart?Fast Pfu Fly DNA Polymerase 北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒美國Axygen公司；溶菌酶 北京Solarbio公司；Nisin 蘭州偉日生物工程有限公司；GABA 美國Sigma公司；M17肉湯培養基 青海海博生物技術有限公司；MRS肉湯培養基 杭州微生物試劑有限公司；其他常用試劑均為國產分析純。實驗中聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物的測序及所需引物的合成工作由美國Invirtrogen公司和上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 培養基及溶液

GM17肉湯培養基：在M17肉湯培養基基礎上添加質量濃度為5 g/L的葡萄糖溶液，即為GM17肉湯培養基；溶菌酶溶液：用TE緩沖液配制成20 mg/mL溶菌酶溶液，-20 ℃保存；Nisin的配制：用0.05%乙酸溶液配制成10 mg/mL的母液，使用時用超純水稀釋為終質量濃度為1 μg/mL溶液。

1.2 儀器與設備

C1000 PCR擴增儀、Gel Doc XR凝膠成像儀、Micro Pulser電穿孔儀 美國Bio-Rad公司；Centrifuge 5804R臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；600液相檢測系統美國Waters公司；JY99-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；723可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；垂直電泳槽 北京市六一儀器廠；DHP-916電熱恒溫培養箱 上海精宏設備有限公司；恒溫水循環儀 上海錦華試驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取-80 ℃冷凍保存于甘油的L. lactis NZ9000菌，解凍后接種于已滅菌的GM17肉湯液體培養基中，30 ℃靜置過夜培養后，之后再次轉接一次，培養至穩定期，即為活化種子培養液。

1.3.2 外源添加GABA對L. lactis NZ9000生長狀態影響的測定

配制MRS肉湯液體培養基分裝于15 mL的離心管中，每管10 mL，滅菌后備用。將活化后的種子液按照2%的接種量分別接種于新鮮的MRS肉湯液體培養基中，向培養基中加入不同濃度的GABA（0、2.5、5、10 mmol/L），每隔1 h在600 nm波長下測量菌液的細胞密度，以時間為橫坐標，以細胞密度（OD600nm）為縱坐標，繪制生長曲線，同時以添加等量的茶氨酸（theanine，THEA）作為對比。根據乳酸菌代謝產生乳酸的特點，采用乳酸調節培養基pH 5.5，其余同上，觀察生長曲線的變化。

1.3.3 外源添加GABA對L. lactis NZ9000抗凍能力影響的測定

取活化后的種子液依照2%的接種量分別接種于新鮮的MRS肉湯液體培養基中，并向培養基中加入不同濃度的GABA。根據生長曲線，分別培養至對數期中期、穩定期前期和穩定期中后期。取這3 個時期的發酵菌液，4℃、10 000 r/min離心5 min。菌泥經0.85 g/100 mL的生理鹽水洗滌3 次后，用等體積的新鮮MRS培養基重懸，按每管1 mL分裝后，分別置于4 ℃和-20 ℃進行冷凍脅迫。同樣以添加等量的THEA作為對比。

每隔一段時間取出菌懸液解凍，4 ℃、10 000 r/min離心5 min后。用等體積生理鹽水洗滌3 次并重懸，取10 μL重懸液，梯度稀釋后點種于MRS培養基平板上，30 ℃靜置過夜培養后測定菌落數，并進行3 次重復。

1.3.4 重組pNZ8148-CsGAD表達載體的構建

pNZ8148-CsGAD食品級表達載體的構建流程如圖1所示。根據已經獲得的茶樹GAD序列，運用Primer 5.0軟件在序列的5’和3’設計一對引物：CsGAD-up：CCGCCATGGATGGTTCTGTCAAAGACA，下劃線處為N c o I酶切位點；C s G A D-d o w n：CCCAAGCTTTTAGCAAACACCATTAGT，下劃線處為HindIII酶切位點。

圖1 重組質粒載體pNZ8148-CsGAD的構建Fig. 1 Construction of recombinant plasmid vector pNZ8148-CsGAD

利用高保真酶從提取的茶樹葉片cDNA中進行PCR擴增，PCR擴增體系為總體積50 μL，Primer STAR Max Premix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，共35 個循環；72 ℃延伸10 min。由于高保真酶擴增后產生平末端，因而擴增結束后可加入1 μL Taq酶72 ℃延伸30 min進行加尾反應，隨后參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書進行PCR產物的純化回收，并利用TA克隆與載體pMD19-T連接[19]，構建pMD19-CsGAD質粒并轉化入大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞，氯霉素平板培養過夜后挑取陽性克隆測序。

確定測序結果與原始序列無誤后，對提取的高濃度pMD19-CsGAD質粒和pNZ8148質粒分別進行NcoI和HindIII酶的雙酶切。酶切體系：10×K Buffer 2 μL，NcoI 1 μL，HindIII 1 μL，質粒DNA（pNZ8148和pMD19-CsGAD分別進行酶切）約3 μL，牛血清白蛋白2 μL，ddH2O補充至20 μL，輕彈管壁混勻，37 ℃水浴3 h，將雙酶切產物分別進行瓊脂糖電泳后，進行凝膠回收。回收酶切產物用T4連接酶進行連接反應。連接體系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，線性去磷酸化pNZ8148載體0.5 ng，酶切后的CsGAD 3 ng，T4 DNA連接酶0.5 μL，ddH2O補充至10 μL。16 ℃連接過夜后于65 ℃滅活15 min，利用DNA Clean-Up System將連接產物純化回收獲得重組的pNZ8148-CsGAD表達載體，再次轉化入大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞，培養過夜后挑菌測序。

確定結果無誤后，搖菌提取pNZ8148-CsGAD質粒，利用電穿孔儀轉入L. lactis NZ9000感受態細胞[20]，30 ℃恢復培養2 h后涂布于含10 ng/mL氯霉素的GM17平板培養基上，30 ℃培養過夜，同時轉入pNZ8148空載體作為對照。挑取陽性克隆進行菌落PCR和質粒雙酶切的驗證。電泳檢測片段大小正確后表明獲得重組乳酸菌L. lactis NZ9000/pNZ8148-CsGAD。

1.3.5 pNZ8148-CsGAD的誘導表達與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測

將導入目的質粒pNZ8148-CsGAD的乳酸菌命名為重組菌，將導入pNZ8148空載體的乳酸菌命名為對照菌。對獲得的重組菌L. lactis pNZ8148-CsGAD利用Nisin進行誘導表達后，利用SDS-PAGE對誘導表達蛋白進行檢測，通過與對照菌總蛋白量進行對比，確定重組菌中GAD蛋白的表達。

活化重組菌L. lactis pNZ8148-CsGAD至5 mL GM17液體培養基中（10 ng/mL氯霉素），30 ℃靜置培養過夜，隨后按照5%接種量轉接至GM17培養基，30 ℃靜置培養至OD600nm為0.45～0.50[21]，加入Nisin溶液使其最終質量濃度為2 ng/mL繼續誘導培養8 h，最后用冷凍的石英砂碾磨提取菌體總蛋白進行SDS-PAGE，檢測誘導表達目的蛋白[22]，以轉入pNZ8148空載體的乳酸菌作為對照菌同時進行處理。

1.3.6 高效液相色譜檢測GABA含量

柱前衍生方法[23]：取樣品1 mL置于10 mL棕色瓶中，加入0.5 mol/L碳酸氫鈉（pH 9.0）溶液1 mL和1% 2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液1 mL，混合均勻，置于60 ℃水浴中暗處反應1 h后取出冷卻，加50 mmol/L氯霉素磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）至刻度。標準曲線的制作：取10 mg GABA標樣，用超純水配制成1 mg/mL的溶液。取1 mL標樣按上述方法衍生后進行梯度稀釋，過0.45 μm濾膜，進樣。

色譜條件：Waters 600液相系統和Waters 2489紫外檢測器，C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）（20∶20∶60，V/V），檢測波長360 nm，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

取1.3.5節中加Nisin誘導后的重組菌與對照菌，4 ℃、10 000 r/min離心5 min。菌泥經0.85 g/100 mL生理鹽水洗滌3 次后，用等體積50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）重懸后超聲破碎細胞，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜，測定GABA含量。

1.3.7 基因工程乳酸菌L. lactis pNZ8148-CsGAD抵御逆境能力的比較

1.3.7.1 抗酸能力的比較

配制GM17肉湯液體培養基，利用乳酸調節培養基pH 5.5和pH 4.0的酸性條件。每管15 mL分裝滅菌，分別將重組菌和對照菌的活化種子液按照5%的接種量加入，并加入10 ng/mL的氯霉素，每隔2 h在600 nm波長下測定菌液的細胞密度，并繪制生長曲線。另外，因為質粒pNZ8148經Nisin誘導后會使蛋白大量產生，在接種的時候再加入2 ng/mL的Nisin誘導液，觀察重組菌和對照菌生長曲線的變化。

1.3.7.2 抗凍能力的比較

將重組菌和對照菌的活化種子液按照5%的接種量分別接種于新鮮的GM17肉湯液體培養基（10 ng/mL氯霉素，2 ng/mL Nisin）中，培養及單位體積菌落數計算方法見1.3.3節，為避免兩種菌培養過程中可能存在的起始數目差異，采用計算存活率的方式進行抗凍能力比較。

1.4 數據統計分析

所有數據利用GraphPad Prism 6.0軟件ANOVA方法進行方差分析及t檢驗[24]，并作圖。

2 結果與分析

2.1 酸性條件下外源添加劑對L. lactis NZ9000生長曲線的影響

圖2 不同培養條件對L. lactis NZ9000生長曲線的影響Fig. 2 Effect of different culture conditions on the growth of L. lactis NZ9000

預實驗結果表明添加不同濃度的GABA對于乳酸菌的生長沒有特別明顯的影響，在添加5 mmol/L GABA時，乳酸菌培養至穩定期細菌的OD600nm最高，因而選擇5 mmol/L GABA作為外源添加劑量進行后續的實驗。考慮到額外添加氨基酸可能會有能量增加的影響，選擇添加THEA作為外源氨基酸添加劑的參比，添加量同為5 mmol/L。由圖2可知，在正常情況下（pH 7.2），外源添加GABA或THEA對L. lactis NZ9000的最大生物量（OD600nm）并無明顯的影響。而在弱酸性培養環境下（pH 5.5），L. lactis NZ9000的生長速率明顯受酸性脅迫影響而放緩，其到達穩定生長平臺期的培養時間由正常條件下的8 h左右延長至14 h左右。同時，外源添加5 mmol/L GABA對于酸脅迫條件下L. lactis NZ9000的生長并無明顯影響；但是另一方面，外源添加5 mmol/L THEA對于酸脅迫條件下L. lactis NZ9000的生長具有明顯的抑制作用。這表明外源添加GABA并不能幫助乳酸菌抵御酸脅迫，而外源添加THEA對于酸性條件下培養的乳酸菌具有較強的抑制作用。

2.2 外源添加GABA對乳酸菌抗凍脅迫的影響

根據測得生長曲線，確定乳酸菌L. lactis NZ9000在正常培養條件下（pH 7.2）到達對數期中期、穩定期前期和穩定期后期的時間分別為4、8、20 h。隨后對培養相應時間的乳酸菌分別進行低溫脅迫處理。

由圖3可以看出，對數生長期中期的菌置于4 ℃時，脅迫處理前期乳酸菌生長會有一個明顯的增長趨勢，但隨著低溫時間延長，菌體逐漸死亡，而在-20 ℃條件下，乳酸菌不能繼續生長，存活數隨著凍存時間逐漸下降。其他培養階段的乳酸菌受到低溫脅迫均會抑制其生長，隨著處理時間延長，存活菌數顯著下降。總體來說，低溫脅迫前期會抑制乳酸菌的生長，并導致緩慢死亡，而后期（處理30 d以后）死亡數會明顯增加，使得菌存活數目明顯下降。處于4 ℃條件下的乳酸菌由于更容易產生冰晶使得存活率明顯低于-20 ℃處理組。外源添加5 mmol/L GABA在大多數培養階段并無作用，僅對處于穩定期中后期的乳酸菌表現出一定的幫助，而外源添加5 mmol/L THEA對于抗冷凍脅迫沒有明顯作用。因而可以排除GABA對乳酸菌抗逆脅迫起到一定作用的原因是由于培養基中能量物質增加所導致。基于此，設計外源表達載體向乳酸菌中導入一段茶樹中的GAD序列，目的是經過Nisin誘導后，乳酸菌自身會大量合成GABA，進而觀察高產GABA情況下乳酸菌抵御逆境的能力。

圖3 不同前培養階段乳酸菌L. lactis NZ9000的冷凍抗性比較Fig. 3 Comparison of anti-freeze ability of L. lactis NZ9000 cells at different growth phases

2.3 pNZ8148-CsGAD表達載體的構建結果

圖4 菌落PCR檢測的結果Fig. 4 PCR results of recombinant bacterial colonies

以改良CTAB法提取的茶樹葉片mRNA為模板，反轉錄為cDNA后利用設計的GsGAD上下游引物進行擴增，得到大小約為1 500 bp的特異性條帶。通過凝膠回收試劑盒回收純化該PCR產物，通過TA克隆與PMD-19T載體連接并轉入E. coli DH5α菌中，挑取陽性克隆測序，結果顯示該序列長度為1 482 bp，與目標基因序列一致。將GsGAD與pNZ8148載體分別進行NcoI和HindIII的雙酶切，然后利用DNA Ligase進行連接，熱擊轉入大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞中，通過藍白斑抗性平板篩選陽性克隆，測序證明無誤后，提取質粒pNZ8148-GsGAD電擊轉入L. lactis NZ9000中獲得基因工程菌L. lactis NZ9000/pNZ8148-CsGAD。以轉入空載體pNZ8148的L. lactis NZ9000作為對照菌，利用菌落PCR檢測轉化結果。由圖4可知，重組菌中可擴增出大小約為1 500 bp的目的條帶，而對照菌擴增無此條帶。

2.4 CsGAD表達產物鑒定及其產GABA能力分析

收集2 ng/mL Nisin誘導8 h的重組菌L. lactis NZ9000/pNZ8148-CsGAD，利用SDS-PAGE分析總蛋白。根據CsGAD序列推算翻譯后蛋白大小約為55.5 kDa。由圖5可知，重組菌總蛋白添加Nisin后與對照菌相比在目的區域有明顯的誘導條帶，表明目的蛋白得到表達。經Nisin誘導表達CsGAD蛋白后，重組菌合成GABA的能力明顯增強，由于L. lactis NZ9000菌株在pNZ8148受Nisin誘導過程中可以持續穩定合成GAD蛋白，保證了GABA的合成與積累，培養8 h后，重組菌中GABA的含量達到對照組的5 倍左右（圖6）。

圖5 SDS-PAGE檢測目的蛋白Fig. 5 Identification of the target protein by SDS-PAGE

圖6 HPLC測定乳酸菌中GABA含量Fig. 6 GABA content detected by HPLC

2.5 基因工程菌抗酸脅迫結果

在正常培養條件下添加Nisin對重組菌和對照菌進行培養，并測定生長曲線，由圖7可以看出，重組菌與對照菌的生長曲線相比發生了明顯的變化。其中對照菌大概在6 h達到了穩定期，而重組菌大約在10 h達到穩定期，但是重組菌到達穩定期的最大生物量大約是對照菌的1.5 倍，說明重組pNZ8148-CsGAD質粒在表達GAD的蛋白情況下大大提高了乳酸菌的生長活力。在弱酸性培養條件下（pH 5.5），重組菌與對照菌的生長均受到抑制，到達穩定期時間延長，而重組菌仍表現出一定的生長量優勢；在pH 4.0的培養條件下，對照菌基本不生長，而重組菌表現出明顯的酸脅迫耐受性。

圖7 酸性培養條件對L. lactispNZ8148-CsGAD生長的影響Fig. 7 Effect of acidic culture conditions on the growth of L. lactis pNZ8148-CsGAD

2.6 基因工程菌抗冷凍脅迫結果

圖8 不同前培養階段的乳酸菌L. lactis pNZ8148-CsGAD的冷凍抗性比較Fig. 8 Comparison of anti-freeze ability of L. lactis pNZ8148-CsGAD cells at different growth phases

由圖8可以看出，利用Nisin誘導表達CsGAD的重組菌在不同培養階段對于低溫脅迫的耐受性均明顯高于對照菌，其中以預培養至穩定前期階段的差異最為明顯。總體來說，預培養至對數期中期和穩定前期的對照菌抵御冷凍的能力均很弱，當處理至15 d時，對照菌幾乎都已死亡，重組菌存活率低于10%；培養至穩定期后期的重組菌抗冷凍能力明顯增強，盡管對照菌的存活率有所上升，但仍能觀察到重組菌的存活率明顯高于對照菌，在4 ℃與-20 ℃脅迫條件下，培養15 d后存活率仍高于10%。表明利用Nisin誘導表達外源CsGAD基因后，高產GABA的乳酸菌相比于對照乳酸菌抗低溫脅迫能力有了明顯提高。

3 結 論

工業化生產時乳酸菌不可避免的遭受到各種逆境脅迫。本實驗對比了外源添加GABA與體內合成GABA兩種模式對于乳酸菌抗逆的影響，結果表明，正常培養條件和酸脅迫條件下，外源添加一定量的GABA對于L. lactis NZ9000的生長狀態沒有明顯的影響。而低溫脅迫情況下，乳酸菌在外源添加GABA相較于未添加物培養條件，表現出一定的生存優勢。這可能是由于這些物質起到了一定的冷凍保護劑作用，抑制冷凍時細胞內冰晶的形成，減少冰晶對細胞膜的損傷，從而減少細菌的死亡[25]。當采用基因工程的方法將一段CsGAD基因導入L. lactis NZ9000，進而利用Nisin誘導GAD合成從而可以體內大量生成GABA時，再觀察重組菌的生長情況發現，重組菌的生物增長量在進入穩定期后達到了對照菌的1.5 倍。在酸性培養條件下，尤其是pH 4的酸性條件下，重組菌的耐酸性明顯高于對照菌，推測是因為重組菌在Nisin誘導后大量產生GAD，而當環境中的pH 4.0～5.5時，GAD就會通過脫羧反應消耗環境中的H+，同時會產生堿性較強的GABA中和H+[26-28]。

有研究表明，處在不同生長期的菌株對冷凍干燥的抗性有很大的差別[29]。一般來說，處在對數生長期末期和穩定期前期的菌體細胞其存活率較高，可能是對數生長期末期和穩定期前期的菌體細胞生長代謝最旺盛、活力也最強，與其他生長階段的菌體細胞相比，耐受不良環境的能力也要強[30-31]。在本次低溫脅迫實驗中，同樣發現普通L. lactis NZ9000在培養至穩定期前期時其抗凍能力要略優于對數期中期和穩定期后期2 個培養階段，但是對于轉入pNZ8148質粒的L. lactis NZ9000乳酸菌來說，處于穩定期后期的菌體冷凍耐受性表現較強，尤其是重組菌存活率明顯高于其他2 個階段，表明Nisin誘導重組菌表達CsGAD以促進GABA合成與積累的過程有助于提高乳酸菌的冷凍脅迫耐受性。綜上所述，利用基因工程手段構建的L. lactis NZ9000/pNZ8148-CsGAD能明顯提高乳酸菌抵御酸性和低溫脅迫的能力，有利于乳酸菌的工業化生產。