基于高通量測序分析蝦夷扇貝柱菌群結構及腐敗優勢菌

江艷華，王聯珠，許東勤,2，李風鈴，翟毓秀，張 媛，姚 琳,*

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，山東 青島 266071；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.獐子島集團股份有限公司，遼寧 大連 116011）

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）隸屬于軟體動物門、瓣鰓綱、異柱目、扇貝科、扇貝屬，是一種冷水性貝類，經過近20 a的養殖推廣，目前已在我國渤海及黃海北部形成規?；彤a業化養殖，創造了數十億元的產值，是我國北方最重要的經濟海水養殖貝類之一[1]。蝦夷扇貝個體較大、味道鮮美、營養豐富，深受消費者的青睞[2]。蝦夷扇貝產品形式多樣，大多以貝柱為主，包括鮮凍貝柱、干貝、即食貝柱等。由于蝦夷扇貝柱組織細嫩、含水量高，在儲運過程中極易發生腐敗變質，即使在較低溫環境下，有些微生物仍然可以繁殖，導致貝柱的變質[3]。然而，微生物對蝦夷扇貝柱品質變化的影響及作用機制目前尚不清楚。因此，有必要分析蝦夷扇貝柱中微生物的菌群結構及其在貯藏過程中腐敗后的菌群結構，了解相關微生物種類，為進一步研究微生物在蝦夷扇貝柱品質劣化中的作用提供基礎資料。

傳統的微生物菌群分析采用培養分離法，然而大多數環境微生物對培養條件要求苛刻，能夠培養分離出的微生物僅占樣品的1%～10%，無法解析微生物的組成及豐度情況[4]。隨著宏基因組學概念的提出和高通量測序技術的發展，使樣品中不可培養的微生物、低豐度的微生物均能被檢測出，更完整地反映樣品中微生物的群落特征，使菌群的分析更準確和快速，目前已經得到廣泛的應用[5-8]。本研究采用宏基因組結合Illumina MiSeq高通量測序技術分析蝦夷扇貝柱的菌群和腐敗菌群，同時與平板分離結合高通量測序技術獲得可培養菌群和腐敗菌群的結構特征進行比對，為進一步探討微生物與蝦夷扇貝柱品質的相關性研究提供參考基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦夷扇貝由獐子島集團股份有限公司提供，為2016年5月采捕，規格為2 a齡，健康狀態良好。扇貝于低溫環境下運抵實驗室后立即處理，處理前仍保持鮮活狀態。

2216E瓊脂培養基 北京陸橋技術股份有限公司；土壤基因組DNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒 美國Omega公司；10×PCR buffer、dNTPs、Taq酶日本Takara公司；Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；Agencourt AMPure XP磁珠核酸純化試劑盒德國Beckman公司。

1.2 儀器與設備

T1型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 德國Biometra公司；PowerPac型電泳儀美國Bio-Rad公司；Infinity3000型凝膠成像系統 法國Vilber公司；Q32866型Qubit?2.0熒光計 美國Invitrogen公司；MiSeq高通量測序儀 美國Illumina公司；3K15型臺式離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

用潔凈水將蝦夷扇貝外殼沖洗干凈，采用無菌手術刀小心將貝柱與其他組織分離開，用無菌水沖洗扇貝柱3 遍。將扇貝柱分別放入無菌樣品袋中，置于4、15、25 ℃放置至樣品腐?。ㄆ渲? ℃放置12 d、15 ℃放置4 d、25 ℃放置2 d，以感官和揮發性鹽基氮作為判定依據）。新鮮扇貝柱和不同溫度下腐敗的扇貝柱分別勻漿后用于基因組DNA的提取。

1.3.2 宏基因組DNA的提取

用土壤基因組DNA提取試劑盒提取新鮮扇貝柱及不同溫度下腐敗扇貝柱的宏基因組DNA，新鮮樣品的宏基因組DNA記為BZ，4、15、25 ℃腐敗樣品的宏基因組DNA分別記為BZ4、BZ15、BZ25。

1.3.3 可培養細菌基因組DNA的提取

無菌操作稱取新鮮樣品及25 ℃腐敗樣品各25 g，分別加入225 mL無菌生理鹽水，勻漿后制成1∶10勻液，進行10 倍梯度稀釋，取適宜稀釋度勻液100 μL涂布2216E瓊脂平板，30 ℃培養48 h。用無菌的TE緩沖液收集平板上所有菌落，8 000 r/min離心20 min，沉淀用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，即為樣品中可培養細菌菌群的基因組DNA[9]。新鮮樣品的可培養細菌菌群的基因組DNA記為BZC，腐敗樣品的可培養細菌菌群的基因組DNA記為BZC25。

1.3.4 PCR擴增及高通量測序

將提取的基因組DNA作為模板，擴增16S rDNA序列的V3-V4可變區，引物序列上加有接頭序列和測序引物序列，以適應MiSeq測序平臺使用，同時正向引物上接有不同堿基的標簽（barcode）序列以區分不同樣品，引物如下：

341F：5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，805R：5’-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGAC TACHVGGGTATCTAATCC-3’[10]。

通過兩輪PCR擴增并完成接頭序列的連接。第1輪PCR體系為50 μL反應液，含10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，50 μmol/L引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，DNA模板10 ng。PCR條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火 20 s，65 ℃延伸30 s進行5 個循環；之后94 ℃變性20 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸30 s進行20 個循環，最后72 ℃延伸5 min。第2輪PCR體系同第1輪，模板為20 ng，PCR條件為：95 ℃預變性30 s，然后95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s進行5 個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR結束后，利用瓊脂糖電泳進行鑒定，采用磁珠核酸純化試劑盒對PCR產物進行回收。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對DNA進行定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司的Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序。

1.4 數據分析

對MiSeq測序得到的數據，首先取出引物接頭序列，再根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接成一條序列，隨后根據barcode區分樣品得到各樣本數據，對各樣本序列進行質量控制，去除序列末端質量值20以下的序列，切除含N部分序列，并去除數據中的短序列，再對低復雜度序列進行過濾[11]。將多條序列按其序列間的距離進行聚類，對相似性在0.97以上的序列進行歸并，生成操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。根據聚類分析結果，計算ACE、Chao1、Shannon、Simpson指數進行alpha多樣性分析，其中ACE、Chao1指數是對菌群豐度進行評估，Shannon、Simpson指數是對菌群多樣性進行評估[12]。采用RDP classifier軟件對序列進行物種分類，根據分類學分析比對結果，在門、屬等水平上對樣品的菌群結構進行種類和豐度分析[13]。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取及PCR擴增

提取的宏基因組DNA和可培養細菌基因組DNA的條帶清晰，有明顯主帶，其中宏基因組DNA有彌散拖尾現象。以提取的基因組DNA作為模板，用16S rDNA V3-V4區的通用引物均擴增出目的片段（圖1），條帶清晰，滿足后續測序實驗的要求。

圖1 PCR擴增產物電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of PCR amplified products

2.2 菌群測序結果質量分析

表1 蝦夷扇貝柱新鮮及腐敗樣品菌群的alpha多樣性比較Table 1 Alpha diversity of bacterial fl ora in fresh and spoiled adductors of P. yessoensis

樣品的基因組DNA經PCR擴增16S rDNA V3-V4區后進行高通量測序，經統計分析獲得序列的alpha多樣性，結果見表1。所有樣本的測序覆蓋率均在93%以上，表明樣品中序列未被測到的概率較低。所測試的樣本中，新鮮樣品的宏基因組（BZ）的測序量和OTUs數量最多，ACE和Chao1指數最低，表明新鮮樣品中菌群相對豐度最低，而Shannon指數最高、Simpson指數最低，表明菌群的多樣性最高。

2.3 細菌菌群結構分析

2.3.1 基于門水平的細菌菌群結構分析

表2 蝦夷扇貝柱新鮮及腐敗樣品菌群在門水平上的分布Table 2 Relative abundance of bacterial phyla in fresh and spoiled adductors of P. yessoensis%

宏基因組DNA樣本序列經RDP classifier軟件進行分類分析，在門水平上，如表2所示，新鮮樣品中的總細菌菌群主要包含變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），相對豐度分別為47.92%、14.99%、12.23%和7.58%，還包括少量的未分類菌（unclassified）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、Ignavibacteriae、柔膜菌門（Tenericutes）等；樣品在4、15 ℃腐敗后的菌群以變形菌門（Proteobacteria）為主，相對豐度分別為98.38%和99.78%，在25 ℃腐敗后的菌群則以變形菌門、梭桿菌門（Fusobacteria）和厚壁菌門為主，相對豐度分別為69.97%、18.94%和11.06%。

對可培養細菌DNA樣本進行測序后發現，新鮮樣品中的可培養細菌菌群99.98%歸屬于變形菌門，在25 ℃腐敗后的可培養菌群以變形菌門（82.57%）和厚壁菌門（17.40%）為主。

2.3.2 基于屬水平的細菌菌群結構分析

在屬水平上的統計分析結果見表3?；诤昊蚪MDNA測序的結果顯示，新鮮樣品中的細菌菌群包含的物種多達100余種，其中相對豐度大于1%的有未分類菌（unclassified）、Candidatus kuenenia、弧菌屬（Vibrio）、別弧菌屬（Aliivibrio）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、科爾韋爾氏屬（Colwellia）、腸球菌屬（Enterococcus）、南極菌屬（Moritella）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、黏著桿菌屬（Tenacibaculum）、陶厄氏菌屬（Thauera）、發光桿菌屬（Photobacterium）、弓桿菌屬（A r c o b a c t e r）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、Ignavibacterium、極地桿菌屬（Polaribacter）、Gp4，占總量的75.35%。當樣品在4、15 ℃和25 ℃放置腐敗后，與新鮮樣品比較，菌群多樣性降低、菌群結構發生了變化，對于一些在新鮮樣品中占比較高的菌，如C. kuenenia在腐敗后未有檢出；而在新鮮樣品中含量較低的發光桿菌屬、別弧菌屬、假交替單胞菌屬、乳酸菌屬（Lactobacillus）、梭桿菌屬（Fusobacterium）等則顯著增多。4 ℃的腐敗優勢菌為發光桿菌屬（46.91%）、別弧菌屬（36.82%）和假交替單胞菌屬（11.01%），15 ℃的腐敗優勢菌為發光桿菌屬（46.97%）和別弧菌屬（43.33%），25 ℃的腐敗優勢菌為發光桿菌屬（41.94%）、別弧菌屬（23.10%）、梭桿菌屬（18.61%）和乳酸菌屬（10.60%）。

表3 蝦夷扇貝柱新鮮及腐敗樣品菌群在屬水平上的分布Table 3 Relative abundance of bacterial genus in fresh and spoiled adductors of P. yessoensis%

對可培養細菌DNA樣本進行測序后發現，新鮮樣品的可培養細菌菌群多樣性降低，89.46%為假交替單胞菌屬，此外含有少量弧菌屬、別弧菌屬、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）等。在25 ℃放置腐敗后，可培養的腐敗優勢菌為弧菌屬（50.98%）、希瓦氏菌屬（17.43%）、乳酸菌屬（10.68%）。結果發現，在總細菌菌群中占優勢的發光桿菌屬、別弧菌屬和梭桿菌屬在可培養細菌菌群中比例大大下降，說明這幾類菌不適宜在分離培養基上生長，而弧菌屬、希瓦氏菌屬、乳酸菌屬則易培養分離，成為可培養的腐敗優勢菌。

3 討 論

由于環境中微生物物種多樣性極其豐富，傳統培養分離法能夠分離出的微生物僅占樣品中總菌群的很小一部分。宏基因組學概念的提出，使環境中不可培養的微生物、低豐度的微生物等均能被檢測出，更完整地反映樣品中微生物的群落特征[6]。高通量測序技術能夠一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，目前的Illumina MiSeq二代測序技術具有高準確性、高通量、高靈敏度和低運行成本等特點，結合宏基因組學技術，使環境中微生物菌群的分析變得更加準確和快速，在生態、醫藥、農業、食品等各個領域得到廣泛應用[5,14-15]。

本實驗通過宏基因組結合Illumina MiSeq高通量測序技術分析了新鮮蝦夷扇貝柱的總菌群結構及在4、15 ℃和25 ℃腐敗后的總菌群結構，其中4 ℃代表冷藏保存溫度，15 ℃代表工廠加工環境溫度，25 ℃代表室溫。結果發現，新鮮蝦夷扇貝柱中的細菌菌群多樣性顯著高于腐敗樣品的細菌菌群。當樣品放至腐敗后，菌群結構發生了變化，在4、15 ℃和25 ℃三個溫度條件下的腐敗優勢菌均含有發光桿菌屬和別弧菌屬，此外，在4 ℃條件下，假交替單胞菌屬相對豐度也較高，在25 ℃條件下，優勢菌群還包括梭桿菌屬和乳酸菌屬。為與宏基因組樣本的結果進行比對，本實驗還采用平板分離結合高通量測序分析了新鮮樣品中可培養菌群及25 ℃條件下腐敗的可培養菌群結構。新鮮蝦夷扇貝柱可培養菌群的多樣性顯著低于宏基因組測序獲得的總細菌菌群，菌群結構也顯著不同，例如可培養細菌中占89.46%的假交替單胞菌屬僅占總細菌菌群的1.73%。25 ℃條件下的可培養腐敗菌群與總腐敗菌群多樣性沒有顯著差異，優勢菌群則不同，以弧菌屬、希瓦氏菌屬和乳酸菌屬為主。雖然不同細菌由于生長速率不同，在瓊脂平板上的菌落大小會稍有差異，提取平板上收集的菌落的基因組DNA不能準確反映樣品中各種細菌的比例，但該方法省時省力，可以確定樣品中可培養細菌的種類，并粗略估算它們的相對豐度，結果可作為參考。

水產品的腐敗變質主要是由微生物產生的酶對蛋白質等的分解作用引起，在酶的作用下，蛋白質分解為氨基酸，然后進一步分解為胺類物質，最后生成硫化氫、氧化三甲胺等[16]。研究表明，在水產品腐敗過程中只有少數部分特定種類細菌占主導地位，造成產品的腐敗劣變，這類細菌被稱為特定腐敗菌[17]。發光桿菌屬屬于變形菌門、弧菌科，竇妍等[18]的研究發現發光桿菌屬廣泛存在于健康和患病的蝦夷扇貝柱中，而在本實驗中，發光桿菌則主要存在于腐敗的扇貝柱中，新鮮扇貝柱中的豐度則很低，可能與不同養殖區域的樣品有關。有研究報道，發光桿菌能夠分解蛋白產生氧化三甲胺，是水產品的特定腐敗菌[19]，本實驗不同溫度下腐敗樣品的總菌群中，發光桿菌豐度均大于40%，表明該菌可能是蝦夷扇貝柱的特定腐敗菌。然而，測定的可培養細菌菌群中，發光桿菌豐度極低甚至在新鮮樣品中未檢測出，表明這類菌不易培養。假交替單胞菌屬是1995年從交替單胞菌屬（Alteromonas）中分出來的一個新屬[20]，該菌僅分布于海洋環境中，能產生蛋白酶等，已被證實是魚貝類低溫貯藏過程中的特定腐敗菌，分解水產品后能夠產生強烈的氨臭味[17,21]。但是目前關于該菌的研究，尤其在引起水產品腐敗變質方面的報道較少。本實驗發現，假交替單胞菌屬在低溫腐敗樣品的總菌群中相對豐度較高，表明該菌較適合低溫的環境，在新鮮樣品的可培養菌群中相對豐度高達近90%，而在腐敗樣品中可培養的比例則極低，表明這類菌大部分不可培養。乳酸菌屬是一類可以發酵碳水化合物，并產生大量乳酸的細菌，廣泛存在于人和動物腸道以及食品中，多數作為益生菌使用，但實際上乳酸菌能夠分解蛋白質以及糖類，可引起肉類的腐敗變質[22]，但目前鮮見乳酸菌引起水產品腐敗的相關研究報道。本實驗中，乳酸菌在25 ℃腐敗后的總菌群和可培養菌群中的豐度結果一致，表明該菌可能是該溫度下的特定腐敗菌，需要進一步實驗證實。別弧菌屬屬于變形菌門、弧菌科，據報道該菌可能引起水產動物的疾病[18,23]，梭桿菌屬屬于梭桿菌門、梭桿菌科，常寄生于人或動物的口腔、上消化道、腸道及泌尿生殖道和土壤中，目前鮮見別弧菌和梭桿菌引起水產品腐敗的相關報道，然而，扇貝柱在不同溫度下腐敗后，別弧菌在總菌群中的相對豐度均很高，在25 ℃梭桿菌的相對豐度也較高，而別弧菌在可培養菌群中的相對豐度則極低，梭桿菌則不可培養，它們是否是扇貝柱的特定腐敗菌，還需要進一步證實。已有的報道表明，弧菌屬的細菌在海洋環境中廣泛存在，種類多，是海洋環境和生物體內最常見的一類條件致病菌，此外，弧菌還具有較強的蛋白質分解能力，是水產品的特定腐敗菌[17,24]。希瓦氏菌屬屬于變形菌門、弧菌科，能夠分解蛋白產生氧化三甲胺和硫化氫，造成魚、蝦、貝等水產品腐敗和不良氣味產生，是目前研究得最多的水產品特定腐敗菌之一[25-28]。通過實驗發現，弧菌屬、希瓦氏菌屬和乳酸菌屬的細菌在蝦夷扇貝柱的可培養菌群中的相對豐度較高，尤其是弧菌的比例高達50%，表明這幾類細菌易培養分離。

蝦夷扇貝生活在海洋環境中，能夠附著或通過濾食富集海洋環境的微生物，這些微生物在加工或儲運過程中影響著產品的質量安全[29-30]。本實驗通過兩種方法測定了蝦夷扇貝柱在新鮮及腐敗狀態下的總菌群結構和可培養菌群結構，兩種方法獲得的結果不同。通過平板分離獲得的可培養菌為活菌，可以進一步研究菌株的致腐能力及機制，目前在防腐保鮮的研究中仍占有重要地位?；诤昊蚪M獲得的菌群結構多樣性和豐度更完整地反映樣品中實際菌群的特征，但部分優勢菌不易培養分離，獲得的優勢菌群是否為特定腐敗菌還需要進一步驗證，如果經驗證腐敗優勢菌與品質劣化呈正相關性，該方法將在水產品的品質變化及保鮮技術研發中得到更廣泛應用。下一步將通過開展基于宏基因組的高通量測序技術分析蝦夷扇貝柱在腐敗過程中菌群變化與品質下降的相關性、腐敗優勢菌對扇貝柱的降解作用等相關研究，從而揭示微生物在蝦夷扇貝柱品質劣化中的作用機制，并為蝦夷扇貝柱保鮮工藝的研究提供基礎。