導致黃酒酸敗的食果糖乳桿菌的分離、鑒定及其檢測條件優化

章志超，吳 鑫*，朱應飛

（江西省食品檢驗檢測研究院，江西國家果蔬產品及加工食品質量監督檢驗中心，江西 南昌 330001）

黃酒是源于中國的特色古酒，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[1]。它是以大米、黍米、粟為主要原料，經加曲、酵母等糖化發酵劑釀造而成的發酵酒，按照產品風格分為傳統型黃酒、清爽型黃酒和特型黃酒[2]。它具有乙醇體積分數低、酒性醇厚、營養豐富和風味獨特等特點[3]，在日常飲用、烹飪和保健等方面的應用廣泛，越來越受消費者的青睞。

黃酒由于乙醇含量低，多為開放式發酵，若生產滅菌不徹底、 貯藏或運輸過程中容易染菌而發生酸敗，主要表現為酒液渾濁沉淀，生酸腐敗或白色菌膜形成，甚至異味發臭，嚴重影響產品質量[4-5]。該問題是我國黃酒行業亟需解決的問題之一。導致黃酒生物性酸敗的微生物多種多樣，如酵母、醋酸菌、假單胞菌、乳酸菌和芽孢桿菌等[6-10]。目前關于黃酒的國家標準中對黃酒的衛生控制僅限于金黃色葡萄球菌和沙門菌[11]，食品安全抽檢項目中也無針對性檢測項目及相應的檢驗方法[12]，食品安全風險顯而易見。

雖然乳酸桿菌導致的黃酒酸敗問題時有報道，但因食果糖乳桿菌導致的黃酒酸敗問題則較為少見，按照食品安全國家標準對乳酸菌的檢測方法則呈培養周期較長的特點，出現了方法適用性不佳等問題，制約了該菌的檢出時效。本研究在通過形態學、生化實驗和16S rRNA基因等方法選擇性篩選出目標腐敗菌——食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans）的基礎上，針對國標方法的不足進一步采用單因素和Box-Behnken響應面試驗對目標腐敗菌的檢測條件進行優化，大大縮短了該菌定量檢出時間，為評估黃酒該類酸敗嚴重程度，解決相關食品安全問題提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒，因微生物自然污染，呈渾濁、異味的某品牌黃酒變質樣品A和同品牌同批次的質量正常樣品B。

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）、MRS（man rogosa sharpe）瓊脂、MRS肉湯、孟加拉紅培養基（rose bengal agar，RBA）、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）、乳酸桿菌生化鑒定套裝北京陸橋生物技術有限公司；其他常規化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

ZXSD-A1430生化培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；AW200SG 厭氧工作站 英國Electrotek公司；C1000touch型聚合酶鏈式反應儀 美國伯樂公司；BG-Power300型電泳儀 美國Baygene公司。

1.3 方法

1.3.1 總酸的測定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[13]方法進行測定。

1.3.2 菌落計數

菌落總數：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[14]進行測定；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》[15]進行測定；霉菌：參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》[16]進行測定；乳酸菌：參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[17]進行測定。

1.3.3 目標腐敗菌的分離、鑒定

參照焦唯楨等[18]的方法，對優勢菌進行培養，純化和鏡檢，并對分離的純菌株進行16S rRNA基因鑒定，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序工作，將結果與NCBI中收錄的其他菌株序列進行比對分析，并運用MEGA 5.1軟件，采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.3.4 菌懸液的制備、接種

將篩選純化得到的菌株于MRS肉湯培養基中活化2 次，再以2%接種量接種于MRS肉湯培養基中，36 ℃培養約48 h，使菌懸液濃度達到8（lg（CFU/mL）），再用生理鹽水稀釋菌液，使最終濃度約為4～5（lg（CFU/mL））（接近黃酒樣品的實際微生物污染水平）。

1.3.5 單因素試驗設計

在GB 4789.35—2016中乳酸菌檢測條件的基礎上，從分離菌株的生長促進因子、pH值和溫度等方面進行單因素試驗分析。單因素試驗基本條件設計為MRS固體培養基、pH 6.2、溫度36.0 ℃[17]。在其他因素不變的情況下，改變其中一個因素，各因素設計的水平梯度為pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；培養溫度27、30、33、36、39、42 ℃；L-半胱氨酸（L-Cys）質量分數0.025%、0.075%、0.125%、0.175%、0.225%；無水乙醇體積分數1%、3%、6%、9%、12%；培養9 d后觀察菌落生長情況。

1.3.6 響應面試驗優化

根據單因素試驗結果，選取培養基pH值、培養溫度、培養基中L-Cys質量分數和乙醇體積分數4 個因素作為自變量，以培養7 d的目標腐敗菌的菌落數作為響應值，進行Box-Behnken響應面設計。每個試驗重復3 次，取其平均值，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.7 優化后的方法確證

分別采用GB 4789.35—2016和優化后的方法對變質樣品A或正常樣品B中乳酸菌數進行檢測，比較檢出數量和檢出時間。

1.4 數據處理與分析

每個實驗重復3 次，數據統計分析采用Microsoft Excel 2007，結果以“ ±s”表示。采用Design-Expert 8.05軟件進行Box-Behnken響應面分析。

2 結果與分析

2.1 目標腐敗菌的分析

表2 不同培養基對黃酒中微生物的菌落計數Table 2 Bacterial colony counts of Rancid Chinese rice wine using different culture media

采用多種常見的非選擇/選擇性培養基對變質樣品和正常樣品中可能存在的微生物進行培養，結果如表2所示：兩類樣品在整個培養過程中，PCA、VRBA和RBA上均無菌落生長；當使用MRS選擇性固體培養基時，培養到第9天，變質樣A中菌落數達到（4.43±0.03）（lg（CFU/mL）），而正常樣中則未檢出乳酸菌。正常成品黃酒中無微生物生長，這與市售黃酒經滅菌工藝，本身菌含量極低，加上其特有的含醇環境有關，而變質黃酒中生長的微生物可能也較為單一。同時通過對樣品總酸（以乳酸計）的測定，變質樣品A的總酸值是同批次正常樣的3 倍，章銀珠等[9]研究的4種壇裝陳化黃酒酸敗后總酸（以乳酸計）僅上升了30%～60%，因此推斷導致黃酒酸敗變質的優勢腐敗微生物可能為乳酸菌，且產酸能力較強。黃酒中總酸的上升則可能與乳酸菌代謝糖類產生乳酸有密切關系[19]。

2.2 乳酸菌的鑒定

采用傾注法MRS培養的平板上長出的菌如圖1A所示，均為乳白色，其中長在培養基內部的菌落呈三角形，表面不規則，如菌ZH-1；表面菌落呈圓形，表面光滑，如菌ZH-2。挑取純化這2 種菌進行革蘭氏染色，結果如圖1B所示，選取的兩株菌均為革蘭氏陽性菌、桿菌，因此推測篩選得到的菌ZH-1和菌ZH-2可能均為乳酸桿菌。按照GB 4789.35—2016的方法進行初步生化鑒定，表3表明：2 株菌的碳水化合物生化反應一致，對照文獻[20-21]，與之類似的菌為食果糖乳桿菌，且文獻[20]中指出該菌具有生長緩慢的特點，與本實驗觀察到的現象吻合。

圖1 篩選菌株的菌落形態（A）和菌體形態（B）Fig. 1 Morphological characteristics of colonies (A) and Gram-staining of isolated bacteria (B)

表3 乳桿菌屬種內常見碳水化合物生化反應Table 3 Carbohydrate fermentation characteristics of L. fructivorans

圖2 根據菌ZH-1和菌ZH-2的16S rRNA基因構建的系統發育進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of ZH-1 and ZH-2

對2 株菌的16S rRNA基因進行鑒定，由細菌DNA為模板，以引物27F、1495R進行聚合酶鏈式反應擴增，得到約1 500 bp的目的片段，測序結果顯示：代表性菌株ZH-1和ZH-2的16S rRNA基因片段長度分別為1 484 bp和1 483 bp。將測序結果用NCBI中BLASTn進行序列同源性分析，菌ZH-1和菌ZH-2均為乳桿菌屬，且這兩株菌均與L. fructivorans NBRC 14747（AB680654.1）和L. homohiochii DSM 20571（NR_114976.1）的相似度最高，相似度為99%。為進一步明確菌株種屬關系，以比對相似度較高的報道菌株及同屬的模式菌株為參照構建系統發育樹，如圖2所示，菌株ZH-1和ZH-2與L. fructivorans NBRC 14747（AB680654.1）聚為一簇，說明分離得到的這兩株菌為食果糖乳桿菌，與生化反應結果相對應。

2.3 目標腐敗菌的確定

表4 黃酒中接種菌株ZH-1和ZH-2后的感官和總酸變化Table 4 Sensory evaluation and changes in total acid concentration of Chinese rice wine inoculated with ZH-1 or ZH-2

如表4所示，為驗證分離菌為目標腐敗菌，實驗中將分離得到食果糖乳桿菌ZH-1和食果糖乳桿菌ZH-2分別接種于正常黃酒中，30 ℃培養2 d后，黃酒呈渾濁、腐敗異味，且總酸分別升高了（0.27±0.02）g/100 mL和（0.20±0.02）g/100 mL，變化顯著，與自然污染的黃酒樣品呈現的腐敗特征一致，因此可以判斷食果糖乳桿菌是導致該黃酒酸敗的原因。乳酸桿菌導致的黃酒酸敗問題報道較多[6,8-9,19]，但多數文獻中除對致腐乳酸桿菌形態進行簡單描述外，無更具體的菌株鑒定數據及菌株種屬信息。食果糖乳桿菌首次在腐敗的沙拉調味汁中被發現[22]，常生長在一些腐敗的酸性或含乙醇的食物中[22-25]，這與黃酒的特性相符。食果糖乳桿菌一般較難分離得到[26]，但發現于酸敗的黃酒中則更少報道，且分離得到的食果糖乳桿菌具有發酵產酸能力強的特點。

2.4 目標腐敗菌培養條件的優化

2.4.1 單因素試驗結果

圖3 不同因素對食果糖乳桿菌生長的影響Fig. 3 Effect of different factors on L. fructivorans growth

在GB 4789.35—2016的檢測方法的基礎上，對目標腐敗菌培養條件進行優化。培養至第9天，菌落生長情況如圖3所示，當改變MRS固體培養基的pH 5.5時，肉眼可計數菌落最多，達到（4.89±0.05）（lg（CFU/mL）），pH值為5.0、6.0和6.5時，均有菌落生長，但均顯著低于pH 5.5的情況，其他pH值條件下則未發現菌落生長；目標腐敗菌在30～42 ℃時，可計數菌落呈下降趨勢，其中培養溫度為30 ℃時目標菌生長最快，培養至第7天即可見微小菌落生長； L-Cys作為一種還原劑能夠降低系統的氧化還原電位，加入培養基中能夠形成更好的厭氧環境，且L-Cys上具有的巰基可作為一些酶的重要小分子底物，促進菌的其他生長代謝[27-30]。考慮到黃酒陳化、貯藏的厭氧或微氧環境，乙醇體積分數不低于8%的特征，且一些報道指出食果糖乳桿菌可能有嗜醇性[21]，為更好地契合目標腐敗菌的實際生長環境，研究考慮將L-Cys和無水乙醇作為目標腐敗菌的生長促進因子。添加一定量的L-Cys或乙醇能夠促使目標菌顯著生長：L-Cys的質量分數在0.075%時，可計數的目標菌數最多；乙醇體積分數為6%時，目標菌則生長最好。

2.4.2 響應面試驗方案設計與結果

根據Box-Behnken響應面試驗設計原理，進行29 次試驗，序號25～29為5 次重復的中心試驗，其余為析因點試驗。對表5中數據進行多元回歸擬合得到菌落數Y對各因素編碼值的回歸方程：

同時對回歸模型進行方差分析，如表6所示，方程極顯著，擬合優度R2為0.98，擬合性較好，說明該方程能夠很好地反映響應值與各因素間的對應關系。由P值可以看出：一次項極顯著，一次項X2顯著，其余不顯著。由于二次回歸正交旋轉組合試驗具有正交性，可以刪除方程中不顯著項[27]，得到方程如下：

由F值大小可以判斷各試驗因素對響應值影響：pH值＞L-Cys質量濃度＞培養溫度＞乙醇體積分數。

表5 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the regression model

2.4.3 響應面交互作用分析與優化

圖4 不同顯著性因素對食果糖乳桿菌生長影響的響應面Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of various significant factors on the growth of L. fructivorans

為進一步研究相關變量之間的交互作用以及確定最優點，繪制響應面曲線圖可進行直觀分析。將沒有顯著性影響的自變量設為零，觀察具有顯著性因素間的交互作用。如圖4所示，各顯著因素在設定的變化范圍內均有最大值，食果糖乳桿菌菌落數較大的培養條件范圍分別為pH 5.4～5.6、培養溫度30～31 ℃、L-Cys質量分數0.07%～0.10%。采用Design-Expert軟件的Optimization模塊，對食果糖乳桿菌的培養條件進行優化，得到最佳培養檢測條件：在MRS固體培養基基礎上，調整pH值為5.42、培養溫度為30.31 ℃、L-Cys質量分數為0.079%、乙醇體積分數為9%，對應的模型預測值為（6.04±0.05）（lg（CFU/mL））。結合實際操作的方便和方差分析結果，確定最佳培養條件為：在MRS固體培養基基礎上，添加質量分數0.08%的L-Cys，調節pH值為5.4，臨用時加入體積分數9%的無水乙醇，培養溫度為30 ℃，采用優化后的培養條件檢測分離的食果糖乳桿菌，培養7 d，實驗值為（5.94±0.03）（lg（CFU/mL）），與預測值接近，可見該模型能較好地預測目標菌的生長。

2.4.4 檢測方法的確證結果

表7 國標方法和優化后的方法對樣品中目標腐敗菌檢測效果評價Table 7 Comparative assessment of GB 4789.35-2016 and the optimization method

為驗證優化后的檢測方法能夠更好地應用于黃酒等實際樣品中腐敗乳酸菌的檢測，分別對采用國標方法和優化后的方法對黃酒變質樣A或正常樣品B進行檢測，如表7所示，檢測方法優化后，培養4 d后即可計數，連續監測第6天和第8天的菌落數結果，無顯著差異；而國標方法培養至第9～10天才能夠計數，菌落數與優化的方法接近，同時采用優化的方法對正常的黃酒樣進行檢測，無菌落生長，排除了假陽性和假陰性的可能。因此該優化的檢測方法適用于導致黃酒變質的食果糖乳桿菌的檢測，檢測時間較國標方法縮短5～7 d。

3 結 論

研究中觀測到的黃酒生物性腐敗呈渾濁、異味和總酸升高等特點。食果糖乳桿菌是導致黃酒變質的目標腐敗菌，該菌在固體培養基上生長緩慢，采用GB 4789.35—2016的方法，需要9～10 d出結果。本實驗通過Box-Behnken響應面試驗設計對食果糖乳桿菌檢測方法進行優化，得到了最優的培養條件為：在MRS固體培養基基礎上，L-Cys添加質量分數0.08%，調節pH值為5.4，臨用時加入體積分數9%的無水乙醇，培養溫度為30 ℃。采用優化后的方法，定量檢出時間為3～4 d，縮短一半以上。針對食果糖乳桿菌引起的酸敗問題，優化的定量檢測條件能夠為較快評估該類黃酒腐敗程度提供參考。