傅里葉變換紅外光譜和紫外光譜數(shù)據(jù)融合對(duì)牛肝菌種類的鑒別

姚 森，劉鴻高，李 濤，李杰慶,*，王元忠*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650221；3.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；4.云南省省級(jí)中藥原料質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)服務(wù)中心，云南 昆明 650200）

云南是我國(guó)牛肝菌種類最豐富的地區(qū)之一，已知牛肝菌224 種，其中可食用牛肝菌144 種[4]。牛肝菌種類繁多，形態(tài)相似，采用傳統(tǒng)方法觀察鑒別難度大，因誤采誤食造成中毒事件時(shí)有發(fā)生[5]，目前對(duì)快速、有效鑒別牛肝菌種類的研究較少，同時(shí)市場(chǎng)上對(duì)食用牛肝菌分類模糊，以次充好的現(xiàn)象屢見不鮮。李艷春等[6]研究了市場(chǎng)上4“種”常見牛肝菌的DNA條形碼，結(jié)果表明4“種”牛肝菌樣品代表了12 個(gè)物種；Dentinger等[7]對(duì)超市購(gòu)買的中國(guó)云南出口美味牛肝菌進(jìn)行DNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)同一包裝袋內(nèi)15 片牛肝菌中有3 種新牛肝菌物種。現(xiàn)今，市場(chǎng)上的欺詐行為嚴(yán)重威脅消費(fèi)者健康，損害消費(fèi)者利益，擾亂食用菌市場(chǎng)。準(zhǔn)確鑒別野生牛肝菌是保障消費(fèi)者安全，維護(hù)人民利益，進(jìn)一步開發(fā)利用和加強(qiáng)市場(chǎng)質(zhì)量監(jiān)控的重要前提。

目前，食用菌鑒別分類研究主要集中在光譜法和分子生物學(xué)方法。Moha?ek-Gro?ev等[8]采集30 個(gè)不同屬野生菌的紅外光譜，對(duì)光譜信息進(jìn)行解析，結(jié)果顯示不同野生菌樣品的紅外光譜差異明顯，其中1 200～1 000 cm-1的差異可以作為不同屬野生菌的特征區(qū)。楊天偉等[9]采用紫外光譜（ultraviolet spectroscopy，UV）技術(shù)結(jié)合主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地、種類可食用牛肝菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明其紫外圖譜具有指紋特性，主成分分析顯示不同種類牛肝菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分積累有明顯差異，可以用于鑒別不同產(chǎn)地、種類食用牛肝菌。Mello等[10]根據(jù)ITS片段設(shè)計(jì)引物，采用分子生物學(xué)方法成功鑒別銅色牛肝菌（Boletus aereus Bull.）和美味牛肝菌（B. edulis Bull.）。單一的光譜法對(duì)樣品有效信息提取率低，容易受到各個(gè)因素（如溫度、濕度、CO2濃度、溶劑等）影響；分子生物學(xué)方法費(fèi)用昂貴，操作復(fù)雜，不適合推廣應(yīng)用。

數(shù)據(jù)融合是將多個(gè)來源信息加以過濾、優(yōu)化、整合，得到更加準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)信息，其目的是通過各儀器間協(xié)同作用，獲得比單一技術(shù)更準(zhǔn)確的分類結(jié)果[11-12]，已被廣泛應(yīng)用于食品、飲料的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)等領(lǐng)域[13-16]。數(shù)據(jù)融合分為低級(jí)融合、中級(jí)融合和高級(jí)融合，低級(jí)數(shù)據(jù)融合是將不同儀器獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單的串聯(lián)，形成更全面的數(shù)據(jù)集[17]；中級(jí)融合是將不同來源的數(shù)據(jù)經(jīng)過特征提取，并對(duì)選取特征變量（如主成分）進(jìn)行整合，去除干擾信息，從而獲得更加豐富、系統(tǒng)的數(shù)據(jù)集[18-19]；高級(jí)融合為決策級(jí)融合，結(jié)合兩個(gè)或兩個(gè)以上分類模型得出最佳鑒別結(jié)果[20]。目前，大多數(shù)學(xué)者采用低級(jí)或中級(jí)融合技術(shù)，僅10%的研究采用高級(jí)融合技術(shù)[21]。在本實(shí)驗(yàn)中，中級(jí)融合分類正確率已經(jīng)達(dá)到100%，因此不對(duì)高級(jí)融合進(jìn)行深入的研究分析。

本研究采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）法和UV法，具有花費(fèi)低、速度快、靈敏度高、可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[22-23]。采用二階導(dǎo)數(shù)（second derivative，2D）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、數(shù)據(jù)融合等方法優(yōu)化樣品信息，通過偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）比較FTIR、UV、低級(jí)融合和中級(jí)融合技術(shù)對(duì)不同種牛肝菌的分類效果，快速及有效鑒別野生食用菌，為加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)控提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用5 個(gè)不同種類牛肝菌（皺蓋疣柄牛肝菌、栗色牛肝菌、小美牛肝菌、美味牛肝菌和雙色牛肝菌）均采自云南省，共272 份樣品，樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 牛肝菌樣品信息Table 1 Information about boletes samples

KBr 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氯仿云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Frontier型FTIR儀（配備硫酸三甘肽晶體氘化檢測(cè)器，掃描范圍為4 000～400 cm-1，掃描信號(hào)累加16 次，分辨率為4 cm-1） 美國(guó)Perkin Elmer公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（掃描范圍190～600 nm，狹縫寬度1 nm） 日本島津公司；SY3200-T型超聲波清洗儀（功率150 W，頻率55 kHz） 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；YP-2型壓片機(jī) 上海市山岳科學(xué)儀器有限公司；FW-100型高速粉碎機(jī) 天津市華鑫儀器廠；80目標(biāo)準(zhǔn)篩盤 浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 FTIR采集

田卓聽完匯報(bào)也很興奮，鼓勵(lì)大家再努力一把，爭(zhēng)取在兩個(gè)月之內(nèi)，就給這個(gè)活動(dòng)畫上一個(gè)完美的句號(hào)。臨散會(huì)的時(shí)候，田卓還專門安排高潮說，高先生，你該提前做新的項(xiàng)目策劃了。從田卓的話音里，高潮可以感覺出她對(duì)自己的策劃能力認(rèn)可了，心里的興奮又陡增了幾分。

樣品采集后清洗干凈，50 ℃烘干，粉碎后過80 目標(biāo)準(zhǔn)篩，備用。按1∶100的比例，準(zhǔn)確稱量（1.5±0.2）mg牛肝菌樣品和（150±20）mg溴化鉀粉末，放入瑪瑙研缽充分混合研磨成細(xì)粉，將細(xì)粉倒入壓制磨具中壓制成片。將FTIR儀預(yù)熱30 min后進(jìn)行FTIR掃描，樣品重復(fù)測(cè)定2 次，取平均光譜；掃描前使用空白樣本扣除CO2和H2O的干擾。

1.3.2 UV采集

稱取（0.1±0.002）g牛肝菌樣品粉末置于石英比色皿中，加入10 mL氯仿溶劑，超聲提取30 min，三層濾紙過濾，取清液備用。紫外-可見分光光度計(jì)預(yù)熱30 min后測(cè)定樣品UV，重復(fù)掃描2 次，取平均光譜，掃描間隔1 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

FTIR儀和紫外-可見分光光度計(jì)在采集光譜信息時(shí)，會(huì)夾雜背景噪音、散光等干擾信息。為消除干擾信息，紅外原始光譜通過OMNIC 8.0軟件進(jìn)行平均光譜、自動(dòng)基線校正、平滑、縱坐標(biāo)歸一化等預(yù)處理，紫外原始光譜采用UV probe 2.34軟件進(jìn)行平滑等預(yù)處理；同時(shí)，采用2D+MSC對(duì)FTIR和UV分別進(jìn)行優(yōu)化處理。

原始光譜經(jīng)預(yù)處理后，選取具有指紋特性的原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行串聯(lián)，形成一個(gè)包含大量變量的獨(dú)立數(shù)據(jù)矩陣，完成低級(jí)融合。采用SIMCA-P+13.0軟件對(duì)FTIR和UV數(shù)據(jù)分別進(jìn)行PLS-DA，提取主成分并整合，進(jìn)行中級(jí)融合。

SIMCA-P+13.0軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行2D、MSC優(yōu)化處理，Origin 8.0軟件作圖，通過SIMCA-P+13.0軟件和MATLAB R2014a軟件分別進(jìn)行PLS-DA和SVM分析，建立判別模型，比較分類結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始FTIR檢測(cè)結(jié)果

釆用OMNIC 8.0軟件對(duì)272 份牛肝菌FTIR進(jìn)行平滑、基線校正和縱坐標(biāo)歸一化等預(yù)處理。選取牛肝菌FTIR特征吸收峰的集中波段在2 000～400 cm-1內(nèi)，用于區(qū)分牛肝菌種類。如圖1所示，不同種類牛肝菌的FTIR較為相似，共有峰波數(shù)大致相同，在1 634、1 480、1 400、1 319、1 253、1 078、1 057 cm-1等波數(shù)附近有明顯吸收峰，但不同種牛肝菌樣品吸收峰的強(qiáng)度有差異。1 634 cm-1附近吸收峰為C＝O伸縮振動(dòng)，為蛋白質(zhì)酰胺I帶；1 480 cm-1附近歸屬為亞甲基的彎曲振動(dòng)；1 400、1 319、1 253 cm-1等附近為多糖、蛋白質(zhì)等的C—O—H彎曲振動(dòng)和亞甲基的變形振動(dòng)；1 078、1 057 cm-1附近分別為糖類的C—O和C—C伸縮振動(dòng)；950～710 cm-1波段有多個(gè)弱吸收峰，主要為糖類異構(gòu)體的特征峰[24-25]。

圖1 5 種牛肝菌的FTIRFig. 1 IR spectra of fi ve boletus species

2.2 原始紫外圖譜分析

在采集樣品UV過程中，容易受到溶劑、儀器、環(huán)境等干擾，采用UV probe 2.34軟件對(duì)牛肝菌樣品進(jìn)行平滑等預(yù)處理。由于在190～230 nm波長(zhǎng)內(nèi)UV受干擾嚴(yán)重，且400 nm以后無明顯特征吸收峰，牛肝菌UV的特征吸收峰集中在230～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，因此選取230～400 nm波長(zhǎng)范圍的171 個(gè)變量作為樣品信息用于區(qū)分牛肝菌種類。如圖2所示，在240～400 nm范圍內(nèi)5 種牛肝菌樣品光譜圖峰形相似度高，在250～350 nm區(qū)間有明顯的特征吸收峰，274、285、296 nm附近為樣品共有峰，表明不同種牛肝菌的化學(xué)組分相似；5 種牛肝菌樣品的峰強(qiáng)、峰位和峰面積存在差異，尤其在230～240 nm區(qū)間差異明顯，具有指紋特性，能夠作為區(qū)分不同種類牛肝菌的依據(jù)。

圖2 5 種牛肝菌的UVFig. 2 UV spectra of fi ve boletus species

2.3 主成分提取

采用PLS-DA提取主成分，R2Y表示主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率，貢獻(xiàn)率越高代表樣品信息越多；Q2表示主成分對(duì)樣品的預(yù)測(cè)能力，Q2越大表示預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)[26]。如圖3所示，當(dāng)Q2達(dá)到最大值時(shí)，F(xiàn)TIR前16 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)90.35%，UV前30 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)74.86%，能夠代表樣品的主要信息。將兩種光譜數(shù)據(jù)的主成分組合在一起，進(jìn)行中級(jí)融合，形成新的數(shù)據(jù)集為進(jìn)一步鑒別分析做準(zhǔn)備。

圖3 PLS-DA提取主成分得分圖Fig. 3 Scores plots for principal components extracted by PLS-DA

2.4 PLS-DA結(jié)果

PLS-DA是基于偏最小二乘回歸的一種有監(jiān)督的判別分類方法，利用自變量矩陣X和分類變量Y建立回歸模型，通過PLS預(yù)測(cè)未知樣品類別的方法[27-28]。采用PLS-DA比較預(yù)處理對(duì)分類效果的影響。圖4顯示，經(jīng)過預(yù)處理后FTIR較UV對(duì)不同種牛肝菌的區(qū)分效果更好；經(jīng)過預(yù)處理后的區(qū)分效果優(yōu)于原始的效果，表明2D和MSC預(yù)處理對(duì)FTIR和UV的優(yōu)化效果較好。

圖4 不同種牛肝菌PLS-DA得分圖Fig. 4 Scores plot for PLS-DA of different species of bolete mushrooms

隨機(jī)選取90 個(gè)樣品（約樣品量的1/3）作為預(yù)測(cè)集，其余182 個(gè)樣品作為訓(xùn)練集。對(duì)FTIR、UV、低級(jí)融合和中級(jí)融合數(shù)據(jù)分別建立PLS-DA判別模型。如表2所示，F(xiàn)TIR技術(shù)與UV技術(shù)相比，F(xiàn)TIR判別模型具有更高的準(zhǔn)確度，表明FTIR結(jié)合PLS-DA建立判別模型對(duì)未知樣品的分類更加準(zhǔn)確。低級(jí)數(shù)據(jù)融合技術(shù)對(duì)不同種牛肝菌的分類正確率高于UV技術(shù)，低于FTIR技術(shù)，表明低級(jí)融合豐富了光譜數(shù)據(jù)，同時(shí)簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)串聯(lián)將無效信息相互疊加，降低分類正確率。結(jié)果與Roussel等[29]的結(jié)論一致，受干擾信息影響，不是所有情況下數(shù)據(jù)融合得到的結(jié)果都優(yōu)于單獨(dú)儀器。同時(shí)，中級(jí)數(shù)據(jù)融合訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的正確率分別達(dá)到98.90%和95.56%，正確率高于單一光譜技術(shù)，分類效果優(yōu)于低級(jí)融合，表明中級(jí)融合技術(shù)在融合過程中去除了大量干擾信息，能夠建立更穩(wěn)定、可靠的判別模型。

表2 PLS-DA對(duì)不同數(shù)據(jù)集的分類結(jié)果Table 2 Results of PLS-DA of different data matrixes

2.5 SVM

SVM是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論的模式識(shí)別方法，主要應(yīng)用于模式識(shí)別領(lǐng)域，能夠解決小樣本、非線性和高維數(shù)等問題，有效防止過擬合現(xiàn)象[30-31]，該方法已被廣泛應(yīng)用于原材料鑒別、食品分析等方面[32-34]。SVM模型選取訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的方法同2.4節(jié)，采用網(wǎng)格搜索法篩選建模的最佳參數(shù)，基于FTIR、UV、低級(jí)融合和中級(jí)融合數(shù)據(jù)分別建立SVM判別模型。如圖5所示，UV技術(shù)分類錯(cuò)誤最多，中級(jí)融合全部分類正確，表明中級(jí)融合對(duì)牛肝菌種類的鑒別效果最佳。

圖5 SVM對(duì)測(cè)試集的實(shí)際分類和預(yù)測(cè)分類圖Fig. 5 Plots of actual and predicted categories of test samples by SVM

表3 SVM對(duì)不同數(shù)據(jù)集的分類結(jié)果Table 3 Results of SVM of different data matrixes

如表3所示，4 個(gè)數(shù)據(jù)集建模穩(wěn)定性依次為中級(jí)融合＞低級(jí)融合＞FTIR＞UV。同時(shí)低級(jí)融合對(duì)樣品的預(yù)測(cè)正確率高于單個(gè)技術(shù)，表明低級(jí)融合數(shù)據(jù)比單個(gè)儀器數(shù)據(jù)更全面，判別效果更好；中級(jí)融合的分類正確率高于低級(jí)融合，證明中級(jí)融合在整合數(shù)據(jù)過程中去除了無效信息，避免兩種光譜信息的互相干擾，提高分類正確率。該結(jié)論與Biancolillo等[19]研究結(jié)果相吻合，多種光譜技術(shù)對(duì)食品進(jìn)行鑒別分析，低級(jí)和中級(jí)數(shù)據(jù)融合區(qū)分效果皆高于單一光譜技術(shù)，并且中級(jí)數(shù)據(jù)融合優(yōu)于低級(jí)數(shù)據(jù)融合。比較表2和表3可知，采用中級(jí)融合技術(shù)建立SVM判別模型，模型穩(wěn)定、可靠，對(duì)不同種牛肝菌鑒別效果最佳。

3 結(jié) 論

采用FTIR法和UV法采集云南地區(qū)常見牛肝菌物種的光譜信息，選擇MSC和2D分別對(duì)牛肝菌FTIR和UV進(jìn)行優(yōu)化處理。優(yōu)化后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA，結(jié)果顯示同種類牛肝菌樣品能較好地聚集在一起，部分不同種類牛肝菌樣品混在一起，難以區(qū)分；表明優(yōu)化處理對(duì)牛肝菌種類區(qū)分效果優(yōu)于原始光譜，且FTIR對(duì)不同種牛肝菌的區(qū)分效果優(yōu)于UV。

采用低級(jí)和中級(jí)數(shù)據(jù)融合策略對(duì)兩種光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行融合，通過PLS-DA和SVM建立分類鑒別模型，并比較FTIR、UV、低級(jí)融合和中級(jí)融合技術(shù)對(duì)不同種牛肝菌鑒別效果。結(jié)果顯示：中級(jí)數(shù)據(jù)融合建立的SVM判別模型預(yù)測(cè)正確率分別為95.56%和100.00%，高于其他模型，表明中級(jí)融合對(duì)不同種牛肝菌區(qū)分效果最佳，且SVM建立分類模型更穩(wěn)定、可靠。中級(jí)融合技術(shù)結(jié)合SVM建立鑒別模型，能夠準(zhǔn)確、有效區(qū)分不同種牛肝菌，為快速鑒別野生食用菌提供有效方法，對(duì)維護(hù)食用菌市場(chǎng)的穩(wěn)定具有重要意義。