Survivin基因沉默促進胃癌細胞凋亡及其機制研究

毛葦 趙心愷 孔燦燦 鄺繼孫 邱敏霞

海南省人民醫院消化科（海口 570311）

胃癌是常見惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康，發病率占全球第5位，病死率占第6位［1］。每年新發病例93.4萬例，且35%以上出現在中國［2］。胃癌常采用手術治療的方法，但預后較差，復發率和轉移率較高，其主要原因是胃癌細胞的惡性增殖導致腫瘤無法控制最終導致死亡，且晚期患者不易采用手術治療［3］。分子靶向治療是目前臨床研究的重點和熱點，因此探究胃癌的發病機制，為胃病的治療提供可靠的潛在靶位點迫在眉睫［4］。Survivin基因為新近發現的凋亡抑制因子，通過抑制凋亡通路下游信號轉導通路發揮作用，具有促進細胞轉化、增殖的作用［5-6］。近年來隨著對Survivin基因的深入研究，其在腫瘤中的作用越來越受到人們的重視。本實驗通過檢測Survivin基因在胃癌組織和癌旁注重中的表達量以及沉默Survivin基因對胃癌MKN?45細胞增殖、凋亡的影響，以此探明Survivin基因促進癌細胞凋亡的作用機制，為胃癌的臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本的收集 50例胃癌和癌旁組織收集于我院2015年5月至2017年12月手術切除的患者，癌旁組織距腫瘤邊緣≥2 cm，并經病理學確認為胃癌。術前患者均未接受任何化療、放療等。其中男患者23例，女患者27例，平均年齡58.12歲。所有樣本的采集均獲得患者或者家屬的同意。

1.2 試劑 人胃癌MKN?45細胞株購自中科院上海細胞庫；蛋白提取試劑盒購自南京建成生物工程研究所；DMEM培養基購自Gibco公司；胎牛血清、CCK8（Cell Counting Kit?8）購自北京碧云天生物技術公司；脂質體Lipofectamine2000、TRizol試劑購自Invitrogen公司；Annexin V?FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；一抗、二抗均購自美國Abcam公司。

1.3 Survivin基因在胃癌及癌旁組織的表達qRT?PCR測定Survivin mRNA在胃癌和癌旁組織中的表達量。根據TRizol試劑說明書提取胃癌和癌旁組織總RNA，反轉錄成cDNA。使用Primer 5軟件設計Survivin和內參β?actin的引物。Survivin引物上游序列為為5′?GGACCACCGCATCTCTAC?AT?3′，下游序列為5′?GCACTTTCTTCGCAGTTT?3′；β?actin 引物上游序列為 5′?GTGGGGCGCCCCAG?GCACC A?3′，下游序列為5′?CTCCTTAATGTCACG?CACGATTTC?3′。PCR反應條件：預變性94℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共 40個循環，72℃延伸10 min。每個樣品設置3個重復，利用2?△△Ct法計算胃癌及癌旁組織中Survivin基因的mRNA相對表達量。

Western blot檢測胃癌和癌旁組織中蛋白的表達量。根據蛋白提取試劑盒說明書提取胃癌和癌旁組織中總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白含量。取60 μg蛋白稀釋成20 μL，加入等體積的1×SDS上樣緩沖液，沸水煮開10 min，10%SDS?聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）電泳，然后轉移至硝酸纖維素膜（PVDF）上，5%的脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗4℃過夜，次日Tris?HCl緩沖鹽溶液+Tween（TBST）洗3遍，與二抗作用2 h，用TBST洗膜3次，滴加Electro?Chemi?Lumi?nescence（ECL）電化學發光顯色液，在凝膠成像系統下測定灰度值。

1.4 細胞培養和轉染 將人胃癌MKN?45細胞置于含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）DMEM培養基中培養中，37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫箱中培養，每24 h換培養基，胰酶消化后，2～3 d傳代1次。

按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書，將Lipofectamine2000和siRNA按1∶1用量，取對數生長的MKN?45細胞按每孔5×105個接種至6孔板中，含10%胎牛血清DMEM培養基培養，當細胞生長達30%～50%時轉染，實驗分3組：（1）空白對照組（Normal）即未轉染的細胞；（2）siRNA對照組（si?Control）中加入5 μL Lipofectamine2000，5 μL錯配的siRNA（50 nmol/L·mL）；（3）siRNA實驗組（si?Survivin）中加入 5 μL Lipofectamine2000，5 μL siRNA?Survivin（50 nmol/L·mL）。Western blot檢測轉染效果。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖 取上述轉染細胞，每孔2 000個細胞接種于96孔板上，37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫箱中培養 24、48、72、96 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，37℃孵育4 h，酶聯免疫檢測儀測每孔以空白組調零，OD450 nm處的吸光值A，每組4個復孔，試驗重復3次，并繪制生長曲線。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取轉染培養48 h的細胞，加入胰酶消化，離心，PBS洗滌后加入400 μL 緩沖液，5μL Annexin V?FITC染色液，8 ℃孵育15 min；加10 μL PI染色液，8 ℃孵育15 min；采用流式細胞儀檢測其凋亡率，試驗重復3次。

1.7 Western blot檢測β?catenin、Cyclin D1、Cas?pase?3蛋白的表達 從培養箱中取出6孔板，PBS清洗細胞，加入300 μL/孔裂解液，離心，加5×SDS上樣緩沖液，沸水煮開10 min，離心，將提取的蛋白保存于-20℃。實驗方法同1.3。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0對數據進行分析，用平均數±標準差表示，兩組差異采用t檢驗，多組間經單因素方差分析，組間多重比較經SNK?q檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin基因在胃癌及癌旁組織中的表達情況 qRT?PCR檢測胃癌和癌旁組織中Survivin mRNA表達量。胃癌中Survivin mRNA表達量為3.384±0.149，癌旁組織中的表達量為0.052±0.007；經統計分析，差異具有統計學意義（t=38.690，P＜0.05）。Western blot檢測胃癌和癌旁組織中Survivin蛋白的表達量。胃癌中Survivin蛋白的表達量為1.358±0.027，癌旁組織中的表達量為0.021±0.008，經統計分析，差異具有統計學意義（t=82.235，P＜ 0.05）。

圖1 Survivin基因在胃癌及癌旁組織中的表達情況Fig.1 expression of Survivin gene in gastric cancer and adjacent tissues

2.2 胃癌MKN?45細胞轉染后Survivin蛋白的表達量 Western blot檢測實驗組（si?Survivin）、對照組（si?Control）、空白組（Normal）胃癌MKN?45細胞中Survivin蛋白的表達水平，3組細胞中Survivin蛋白的表達水平分別為（0.203±0.015）、（0.987±0.053）、（0.936± 0.046），3組整體比較差異具有統計學意義（F=336.276，P=0.000）。如圖2所示，si?Survivin組Survivin蛋白表達量顯著低于si?Control組、Normal組（P＜ 0.05）。

2.3 轉染后胃癌MKN?45細胞增殖情況 如圖3所示，siRNA?Survivin轉染人胃癌MKN?45細胞后，細胞增殖明顯受到抑制，增殖抑制效果隨著時間的增加越來越明顯，從48 h開始差異有統計學意義（P＜ 0.05），與Normal組相比，si?Survivin組72、96 h時差異有統計學意義（P＜ 0.05）；si?Control組與Normal組差異無統計學意義。

圖2 si?Survivin轉染胃癌MKN?45細胞后Survivin蛋白的表達Fig.2 Expression of Survivin protein of gastric cancer MKN?45 cells after transfected with si?Survivin

圖3 si?Survivin轉染胃癌MKN?45細胞后細胞生長曲線Fig.3 cell growth curve of gastric cancer MKN?45 cells after transfected with si?Survivin

2.4 轉染后胃癌MKN?45細胞凋亡情況 流式細胞儀檢測實驗組（si?Survivin）、對照組（si?Control）、空白組（Normal）胃癌MKN?45細胞凋亡率。如圖4，表1所示，si?Survivin組MKN?45細胞凋亡率為（28.76 ± 3.46）%，si?Control組和Normal組分別為（6.38±1.03）%、（5.89±1.13）%。統計分析結果顯示si?Survivin組細胞凋亡率顯著高于si?Control組和Normal組（P＜ 0.05）；si?Control組和Normal組間細胞凋亡率差異無統計學意義。

圖4 轉染si?Survivin對MKN?45細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of apoptosis of MKN?45 cells after transfected with si?Survivin

表1 轉染si?Survivin對MKN?45細胞凋亡的影響Tab.1 Effect of apoptosis of MKN?45 cells after transfected with si?Survivin

2.5 轉染胃癌MKN?45細胞對β?catenin、Cyclin D1、Caspase?3蛋白表達量的影響 Western blot檢測轉染si?Survivin后胃癌MKN?45細胞caspase3、β?catenin、Cyclin D1的蛋白表達量。如圖5、表2所示，caspase?3蛋白在si?Survivin組的表達量顯著高于 Normal組和 si?Control組（P＜ 0.05）；β?catenin、Cyclin D1蛋白在si?Survivin組的表達量顯著低于Normal組和si?Control組（P＜ 0.05）。

圖5 轉染si?Survivin后Caspase3、β?catenin、Cyclin D1的蛋白表達Fig.5 The expression of Caspase3，β?catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si?Survivin

表2 轉染si?Survivin后caspase3、β?catenin、Cyclin D1的蛋白表達量Tab.2 The expression of Caspase3，β?catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si?Survivin ±s

表2 轉染si?Survivin后caspase3、β?catenin、Cyclin D1的蛋白表達量Tab.2 The expression of Caspase3，β?catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si?Survivin ±s

蛋白caspase3 β?catenin Cyclin D1 Normal 0.052±0.016 0.942±0.089 0.589±0.042 si?Control 0.050±0.019 0.953±0.071 0.591±0.030 si?Survivin 0.136±0.015**0.310±0.037**0.162±0.013**F值25.753 85.095 193.986 P值0.001 0.000 0.000

3 討論

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）的成員之一，在腫瘤細胞增殖、凋亡、以及血管形成過程中發揮重要作用。近年來，Survivin對細胞的強抑制能力成為研究的熱點之一［7］。腫瘤的發生與細胞凋亡、增殖能力密切相關。細胞增殖、凋亡是一種復雜的生理性過程，由一系列基因、信號傳導通路共同作用調節，對維持細胞內環境穩態有很重要的作用［8］。研究顯示，Survivin在多種腫瘤中高度表達如原發性肝外膽管癌［9］、膀胱癌［10］、乳腺癌［11］、食管癌［12］等，但在正常組織中不表達或低表達。本實驗通過qRT?PCR和Western blot檢測胃癌組織和癌旁組織中Survivin mRNA、蛋白的表達量，結果顯示，Survivin mRNA和蛋白在胃癌組織中高表達，但在癌旁組織中低表達，與前人的研究結果［13］一致，為胃癌的臨床診斷提供依據。

RNA干擾（RNA inference，RNAi）是一種由雙鏈RNA（diuble strand RNA，dsRNA）引發的特異性序列抑制其同源基因沉默的技術，出現時間雖較晚，但因其高度的專一性而具有廣泛的研究和應用。目前該技術廣泛應用于細胞培養、哺乳動物研究中，為眾多基因功能的作用及機制的探索開辟了新路徑。在子宮腺肌病中，Survivin的過表達可促進細胞增殖、侵襲［6］。研究［12］顯示，抑制腫瘤組織中Survivin的表達，能夠促進腫瘤細胞凋亡，抑制其增殖，進而提高治愈率。特異性沉默Survivin能顯著抑制胃癌MGC?803細胞增殖，并增強其對塞來昔布的敏感性，為提高胃癌的化療效果提供實驗基礎［14］。在本實驗中，通過siRNA轉染人胃癌MKN?45細胞，經檢測顯示，轉染后的細胞中Survivin蛋白的表達量下降，且對細胞的增殖速度起到抑制作用，促進其凋亡，提示在胃癌的發生發展中，Survivin基因發揮癌基因的作用，為分子靶向治療胃癌提供潛在靶點。

天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase?3）是Caspase家族的成員之一，調控細胞凋亡過程［15-16］。Sur?vivin基因調節細胞凋亡主要通過參與細胞有絲分裂和直接抑制 caspase?3 活性［17］。由研究［18］報道，在白血病中誘發Caspase?3表達上調可促進細胞凋亡，這對于腫瘤的治療具有重要作用。Wnt/β?catenin信號通路調控細胞的增殖分化過程，該通路的異常與多種腫瘤的發生、發展有密切關系［19-20］。β?catenin是Wnt信號通路的關鍵調節因子，其表達量可影響c?myc、Cyclin D1等靶基因的表達以此調節細胞的增殖、凋亡。β?catenin蛋白的表達可作為早期診斷胃癌的指標，其表達量可調控胃癌的發生［21］。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）參與細胞有絲分裂過程，可調節細胞周期的變化［22］。本實驗的研究結果顯示，沉默Survivin可有效降低β?catenin、Cyclin D1蛋白的表達，且Caspase?3蛋白的表達量上調，說明Survivin可能通過與β?catenin、Cyclin D1和Caspase?3等凋亡相關蛋白共同作用，調節腫瘤細胞的凋亡率。

綜上所述，Survivin基因和蛋白在胃癌組織中高度表達；RNA干擾沉默人胃癌Survivin基因的表達可通過抑制Wnt/β?catenin信號通路降低癌細胞的增殖及促進凋亡。但Survivin在胃癌細胞增殖、凋亡調控中的具體作用機制尚需進一步的探討。此研究為臨床上胃癌的基因診斷及靶向性治療提供了理論基礎。