達氟沙星對豬胸膜肺炎放線桿菌的體外藥效研究

王申森，徐士新

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)為現代養豬業危害重大的呼吸道細菌傳染病之一。目前，國內外都未見達氟沙星對豬胸膜肺炎放線桿菌的折點值的報道[1]。本文對收集和分離到的48株豬胸膜肺炎放線桿菌進行了達氟沙星體外敏感性測試，以制訂流行病學折點，指導臨床治療用藥，并為該病的預防和控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 胰酪胨大豆瓊脂培養基(161212)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(150507)，購自北京陸橋技術股份有限公司。氧化型輔酶Ⅰ購自羅氏公司，滅菌超純水配制為NAD儲存液(10 mg/mL)備用。胎牛血清購自德國PAN Biotech公司。營養瓊脂培養基、96孔藥敏試驗板(160722，含氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、磺胺異惡唑、復方新諾明、頭孢噻呋、氟苯尼考、多西環素、慶大霉素、大觀霉素、四環素、黏桿菌素、恩諾沙星、氧氟沙星)，購自天津市金章科技發展有限公司。甲磺酸達氟沙星對照品(H0201210)購自中國獸醫藥品監察所，用滅菌超純水配制為達氟沙星儲存液(1024 μg/mL)過膜備用。麥氏比濁儀購自梅里埃公司。

1.2 菌株來源 豬胸膜肺炎放線桿菌CVCC 3559、3560、3571、3572、3573、3574、3575、3576、3577、3578、3579、3580、3581、3581、3582、3583、3584、3585、3586、3587、3588、3589、3591、3592、3593、3594、3595、3599、3600購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心，分離自傳染性胸膜肺炎病豬肺。APP1-20菌株由河南省農業科學院畜牧獸醫研究所惠贈，分離自病豬肺和氣管。大腸桿菌ATCC 25922購自美國模式培養物研究所，由其實驗室傳代保存。

1.3 達氟沙星藥敏板的制作 用微量加樣器在無菌96孔板每孔內加入50 μL TSB培養基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)。用微量加樣器在無菌96孔板第1、3、5、7排第1孔中加入50 μL達氟沙星儲存液，充分吹吸混勻后吸取50 μL至第2孔內吹吸混勻，用同樣的方法依次稀釋至第2、4、6、8排第10孔。此時每孔中達氟沙星濃度依次為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.0078 μg/mL。

1.4 細菌培養 將保存的胸膜肺炎放線桿菌三區劃線接種于TSA平板(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，37 ℃培養18～24 h。ATCC 25922三區劃線接種于營養瓊脂培養基，37 ℃培養18～24 h。

1.5 生長曲線的繪制 取1支無菌圓底試管加入5 mL TSB培養基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，將過夜培養的CVCC 3594胸膜肺炎放線桿菌挑取單菌落于圓底試管中。將圓底試管置于37 ℃搖床，180 r/min培養。按照設定時間點0、1、2、4、6、8、15、24 h，取100 μL培養物用PBS溶液做一系列10倍梯度稀釋后，均勻涂布于平板上，37 ℃孵育24 h后，選取菌落數30～300平板進行活菌菌落計數。

1.6 藥敏試驗 參考美國臨床和實驗室標準協會推薦的微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗和結果判定[2]。取5 mL無菌生理鹽水，將受試菌濃度調至0.5麥氏比濁度。用微量加樣器精密吸取100 μL菌懸液加至10 mL TSB培養基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，制成受試菌液。選擇編號1～10菌株進行初步藥物敏感性測試。無菌操作，在商品化藥敏板每孔加入100 μL受試菌液，第8排11孔加入100 μL受試菌懸液作為陽性對照(有菌無藥)，12孔加入100 μL TSB培養基作為陰性對照(無菌無藥)。全部菌株進行達氟沙星藥物敏感性測試。在自制達氟沙星藥敏板每孔加入50 μL受試菌液，并設置陽性對照(有菌無藥)和陰性對照(無菌無藥)。每株受試菌做3組平行測定。選用大腸桿菌ATCC 25922為質控組菌株。整個96孔板加好受試菌液并蓋上蓋后，在工作臺面緩慢螺旋推動使每孔內液體充分混勻，置于37 ℃生化培養箱培養18～24 h。在黑色桌面或白熾燈燈箱上觀察結果并記錄。

觀察最小抑菌濃度試驗結果后，取達氟沙星藥敏板有藥有菌無生長孔內的液體培養物100 μL接種于TSA平板上，置于37 ℃生化培養箱孵育24 h。無菌落生長平板所對應的達氟沙星藥物濃度即為達氟沙星對受試菌的最小殺菌濃度(MBC)值。

1.7 達氟沙星殺菌曲線 選擇CVCC 3594豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(達氟沙星MIC值為0.0078 μg/mL)作為體外殺菌研究對象。取無菌試管，用1 mL TSB培養基(5%胎牛血清和0.1% NAD)將達氟沙星稀釋成一系列濃度梯度，依次為0、1、2、8、16、32、128 MIC。每支試管中依次加入1 mL菌懸液(2.0×106CFU/mL)。此時每支試管內達氟沙星濃度依次為0、0.5、1、2、4、8、64 MIC，菌液終濃度約為106CFU/mL。充分混勻后于37 ℃搖床培養。另取一支試管加入1 mL TSB培養基和1 mL無菌生理鹽水作為空白對照。

按照設定時間點0、0.5、1、2、4、6、8、15、24 h，取100 μL培養物做梯度稀釋后均勻涂布于平板上，置于37 ℃生化培養箱孵育24 h，選擇菌落數為30～300個的平板進行活菌菌落計數。

2 結果與分析

2.1 生長曲線 按照設定時間點進行菌落計算，具體計數結果見表1。

表1 CVCC 3594菌落計數Tab 1 Counting on CVCC 3594 colonies

以時間(x)和該時間對應菌數的對數(y)繪制CVCC 3594的生長曲線(圖1)。由生長曲線可知，在0～2 h左右處于生長遲緩期，2～8 h左右處于對數生長期，8～18 h以后處于穩定生長期。菌液振蕩培養2～7 h可得對數生長期菌液，7～18 h可得穩定期菌液。試驗時可根據需要控制生長時間獲得不同生長狀態的菌液。

2.2 藥敏試驗結果 有細菌生長時孔內液體呈彌散狀渾濁或孔底有明顯的圓形沉淀。無細菌生長時孔內液體清亮。無細菌生長孔所需藥物最低濃度值即為該藥對受試菌的最小抑菌濃度(MIC)值。ATCC 25922結果符合判定標準，說明試驗操作和流程符合CLSI操作規范，結果可信。對氨芐西林、磺胺異惡唑、頭孢噻呋、大觀霉素、黏菌素耐藥率高，表現出多重耐藥。對阿莫西林/克拉維酸、復方新諾明、氟苯尼考、多西環素、慶大霉素、四環素、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星敏感。具體藥敏結果見表2。

圖1 CVCC 3594生長曲線Fig 1 Growth curve of CVCC 3594

抗菌藥物判定標準/(μg·mL-1)試驗結果/(株/%)耐藥耐藥敏感氨芐西林≥329(90)1(10)阿莫西林/克拉維酸≥160(0)10(100)磺胺異惡唑≥51210(100)0(0)復方新諾明≥40(0)10(100)頭孢噻呋≥89(90)1(10)氟苯尼考≥160(0)10(100)多西環素≥160(0)10(100)慶大霉素≥160(0)10(100)大觀霉素≥1287(70)3(30)四環素≥160(0)10(100)黏菌素≥46(60)4(40)恩諾沙星≥20(0)10(100)氧氟沙星≥80(0)10(100)達氟沙星≥80(0)10(100)

達氟沙星對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌最小抑菌濃度(MIC)分布如表3所示。

達氟沙星對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌最小殺菌濃度(MBC)分布如表4所示。

表3 達氟沙星最小抑菌濃度Tab 3 Minimal inhibit concentration of danofloxacin

表4 達氟沙星最小殺菌濃度Tab 4 Minimum bactericidal concentration of danofloxacin

圖2 MIC值分布Fig 2 Data distribution of minimal inhibit concentration

本試驗受試菌株有CVCC編號菌株28株和APP編號臨床分離菌株20株。將CVCC編號菌株和APP編號菌株的藥物敏感性試驗結果進行對比。CVCC編號菌株因分離年代較久，大部分菌株對達氟沙星的保持較高的敏感性，MIC和MIB值集中于0.0078 μg/mL。APP編號臨床菌株因為伴隨著抗生素的使用，其對抗菌藥物的敏感性和耐受性可能已經發生改變。分離菌株的MIC和MBC值分布不集中，且有6株菌的MIC值為4 μg/mL，8株菌的MBC值為4 μg/mL。說明臨床豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌對達氟沙星的耐受已經增加，可能出現耐藥風險(圖2)。

2.3 達氟沙星體外殺菌曲線繪制 以時間(x)和該時間對應菌數的對數(y)繪制達氟沙星對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的殺菌曲線。由殺菌曲線可得，達氟沙星濃度在1MIC及以上時，隨著濃度增加，殺滅全部細菌所用時間逐漸縮短，曲線明顯左移。說明濃度增加導致殺菌速率加快。當達氟沙星濃度為0.5MIC時，可以維持一定的抑菌作用(圖3)。

圖3 達氟沙星殺菌曲線Fig 3 Killing curve of Danofloxacin on Actinobacillus pleuropneumoniae

3 討論與結論

豬傳染性胸膜肺炎在世界各地廣泛分布，已經成為現代養豬業危害重大的呼吸道細菌傳染病之一[3]。該病發病急、病程短、死亡率高，被認為是世界性工業化養豬的五大疫病之一，在我國多地呈流行趨勢，已有20多個省份對該病進行報道。對其病原菌胸膜肺炎放線桿菌進行耐藥性控制研究，可以為臨床治療豬傳染性胸膜肺炎時使用藥物提供理論依據，根據對不同藥物的敏感性差異選擇合適治療藥物，科學合理用藥，為PK/PD折點的制定提供藥理學研究數據。

在本次試驗中，選擇10株胸膜肺炎放線桿菌進行初步的藥敏試驗。結果表明豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌對氟苯尼考、四環素類和氟喹諾酮類藥物具有敏感性；對氨芐西林、磺胺異惡唑、大觀霉素等臨床常用藥物，已表現出耐藥性。磺胺異惡唑、大觀霉素等因為其抗菌譜廣、毒副作用小、價格低等優點，在養殖業中常用來作為預防性藥物使用[4]。長期不合理的使用導致微生物耐藥性的產生或耐藥基因的轉移，以及臨床菌株對藥物的敏感性降低。張云峰等[5]從新疆地區分離到的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌對氨芐西林敏感，倪莉等[6]從重慶地區分離到的豬傳染性胸膜肺炎對恩諾沙星和四環素類藥物不敏感，與本次試驗結論存在差異，這可能與發病地區抗菌藥物使用程度有關。治療時應篩選出流行地區的病原菌所敏感的藥物進行針對性治療，避免抗生素濫用。

根據初步藥物敏感性試驗結果，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌對氟喹諾酮類藥物敏感。其中達氟沙星為動物專用藥物，給藥吸收后容易集中于肺部，且肺部藥物濃度約為血藥濃度的5～7倍，常用于治療畜禽呼吸道疾病[7]。選擇達氟沙星作為研究對象，進行其對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的體外藥效學研究。殺菌動力學試驗結果表明，當達氟沙星濃度在高于MIC時，隨藥物濃度增加，殺滅細菌所用時間逐漸縮短，是一種典型的濃度依賴型抗生素。在治療用藥時應合理設置給藥劑量和給藥間隔，使靶部位的藥物濃度維持在MIC以上，保證抗感染治療的效果。合理的給藥方案應需要綜合來自體外和體內研究的試驗數據，本次試驗可作為初步研究，提供數據基礎。

將MIC分布制作直方圖后觀察是否存在野生型菌株和MIC異常偏高的菌株，通常低MIC的菌株相對更為敏感。根據野生型菌株MIC分部范圍的上端，定義野生型臨界值即流行病學折點[8]。本次試驗受試菌株MIC值集中在兩個區域，將較低的MIC范圍上端0.5 μg/mL判定為藥物敏感性折點。確定一種病原菌的流行病學折點至少需要100株該細菌的MIC數據，在今后的工作中應進一步收集有關試驗參數，為折點的制定提供數據基礎。目前關于折點數據已經有美國標準和歐盟標準，但折點標準受到時間、地域和用藥的影響而有不同，我國也應根據我國國情加快制定適用的折點標準。

耐藥性控制還需要獸藥管理和監督部門加強抗生素藥物的規范化管理，避免抗生素的濫用。臨床獸醫師進行治療時應指導養殖人員對藥物進行合理的使用，在保證治療效果的同時控制藥物使用劑量和給藥間隔，降低耐藥性菌株產生的風險，延長抗菌藥物在臨床的使用壽命，從而保證動物和人類的健康安全。