高效液相色譜法測(cè)定刺五加甘草顆粒中紫丁香苷的含量

姚路路，張 聰，潘貴珍，周德剛，田曉龍，張曉會(huì)

(1. 洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471000；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，洛陽 471000)

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根莖或莖，具有抗炎、提高機(jī)體免疫力、抗病毒、抗過敏等功效，刺五加多糖對(duì)雞免疫功能具有顯著的增強(qiáng)作用，其中紫丁香苷是刺五加的重要活性成分[1-2]。甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)為豆科植物甘草屬的干燥根和根莖，甘草中的甘草酸具有抗炎、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等多種生物活性[3-4]，總黃酮有抗慢性不可預(yù)知應(yīng)激抑郁作用[5]，多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用[6]。

刺五加甘草顆粒是由刺五加和甘草兩味藥材組成，采用水提醇沉法，上清液減壓濃縮后，加入適量的輔料，制粒即得，可提高畜禽免疫力，用于雞傳染性支氣管炎的治療。

紫丁香苷作為刺五加的重要活性控制指標(biāo)，文獻(xiàn)中報(bào)道的刺五加中紫丁香苷含量測(cè)定主要為刺五加藥材或刺五加單方制劑中紫丁香苷的含量測(cè)定[7-13]，對(duì)刺五加甘草顆粒中紫丁香苷的含量測(cè)定方法進(jìn)行了相關(guān)研究，建立了刺五加甘草顆粒中紫丁香含量的高效液相色譜測(cè)定方法，可為刺五加甘草顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Waters e2695高效液相色譜儀，配2489型紫外檢測(cè)器，美國Waters公司；KQ-500超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，AB135-S型電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；乙腈，HPLC級(jí)，MERK公司；水為超純水。

1.2 試藥 紫丁香苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111574-200603，含量：100%)、刺五加甘草顆粒(洛陽惠中獸藥有限公司，批號(hào)：20170801，20170802，20170803，規(guī)格：每100 g相當(dāng)于原生藥160 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 × 4.6 mm，5 μm)；梯度洗脫，流動(dòng)相：乙腈-水(0 - 7 min，乙腈11%；7 - 8 min，乙腈由11%上升到40%；8 - 13 min，乙腈40%；13 - 14 min，乙腈由40%下降到11%；14 - 20 min，乙腈11%)，流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：265 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 取紫丁香苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制溶解制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密吸取對(duì)照品貯備液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，稱取粉末約1.5 g，精密稱定，置小燒杯中，用50%甲醇20 mL，分次溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，超聲處理(功率250 W，頻率50k Hz)30 min，取出，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方制備缺刺五加的陰性對(duì)照樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液，

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。從圖中可見，供試品溶液在與對(duì)照品色譜中紫丁香苷相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照在紫丁香苷相應(yīng)保留時(shí)間處無干擾峰。

2.4 線性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，分別精密量取對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋，制得濃度為0.01218，0.02030，0.04060，0.06090，0.08120 mg/mL的一系列溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進(jìn)樣濃度(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=3×107C-13800，r=0.9999。表明紫丁香苷進(jìn)樣量在0.01218～0.08120 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液(0.04060 mg/mL)，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取刺五加甘草顆粒(批號(hào)：20170801)，按照“2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，分別制備6份，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取刺五加甘草顆粒(批號(hào)：20170801)，按照“2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為0.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1. 紫丁香苷對(duì)照品 2. 供試品 3. 陰性對(duì)照1. Reference Substance of Syringin 2. Test sample 3. negative control圖1 專屬性考察色譜圖Fig 1 The chromatogram of Specific inspection

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的刺五加甘草顆粒樣品6份(批號(hào)：20170801，紫丁香苷含量：0.738mg/g)，每份約0.8 g，精密稱定，置小燒杯中，各精密加入0.1015 mg/mL的紫丁香苷對(duì)照品溶液5 mL，按照“2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按含量測(cè)定方法操作，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定樣品含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1，加樣回收率在96.46%～99.53%之間，平均值為98.4%，RSD為1.2%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.9 耐用性試驗(yàn) 取刺五加甘草顆粒(批號(hào)：20170801)，按照“2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，當(dāng)柱溫、流速發(fā)生微小變化以及使用不同型號(hào)的色譜柱，分別測(cè)定樣品的峰面積，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫、流速發(fā)生微小變化以及使用其他型號(hào)的色譜柱時(shí)，對(duì)含量測(cè)定結(jié)果基本無影響，表明方法耐用性良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The results of recovery test

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of durability test

2.10 三批樣品含量測(cè)定 取刺五加甘草顆粒樣品(20170801，20170802，20170803)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算刺五加甘草顆粒中紫丁香苷的含量，三批樣品測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 The results of sample content determination

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)波長的選擇 通過紫外掃描，紫丁香苷在265 nm處有最大吸收，因此選擇265 nm為檢測(cè)波長。

3.2 提取溶劑及提取時(shí)間的選擇 參考《中國獸藥典》二部中刺五加藥材及刺五加浸膏含量測(cè)定項(xiàng)下供試品的處理方法，比較了甲醇、75%甲醇、50%甲醇作為提取溶劑對(duì)紫丁香苷含量的影響，結(jié)果50%甲醇對(duì)紫丁香苷的提取效果最好，因此選擇50%甲醇作為提取溶劑；同時(shí)考察了超聲10、20、30 min對(duì)紫丁香苷含量的影響，結(jié)果超聲30 min紫丁香苷的提取效果最好，因此選擇超聲30 min。

3.3 色譜條件的考察 本試驗(yàn)考察了甲醇-水(20∶80)、乙腈-水(11∶89)、乙腈-0.1%磷酸溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水(20∶80)、乙腈-0.1%磷酸溶液條件下，陰性對(duì)照品在紫丁香苷對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處有干擾，乙腈-水(11∶89)條件下陰性對(duì)照品在紫丁香苷對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾，重復(fù)進(jìn)樣發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照品在紫丁香苷對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間處會(huì)有干擾，研究發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照品中干擾峰保留時(shí)間過長，在第二針色譜圖中出峰，因此為確保陰性對(duì)照品中色譜峰能被完全洗脫，將流動(dòng)相改為梯度洗脫，紫丁香苷的保留時(shí)間為8 min左右，與相鄰峰分離度好，峰型良好。

采用高效液相色譜法測(cè)定刺五加甘草顆粒中紫丁香苷的含量，方法簡便、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。