膜分離技術在魚腥草芩藍口服液制備工藝中的應用

陸 安，杜紅娜，劉炳煒，郭 寬，李 芳，郭永紅，郭永國

(1.河北維爾利動物藥業集團有限公司，石家莊 050200； 2.河北省功能性飼料添加劑工程技術研究中心，石家莊 050200；3.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術研究中心，石家莊 050200)

魚腥草芩藍口服液的處方來源于《國家中成藥標準匯編內科肺系(一)分冊》收載的復方魚腥草合劑[1]，由魚腥草、黃芩、板藍根、連翹、金銀花五味中藥組成，該制劑具有清熱解毒的功效，用于外感風熱引起的咽喉腫痛、急性咽炎、扁桃體炎有風熱癥候者。與家禽外感發熱癥候相似，臨床試驗結果表明，該制劑對于家禽因外邪入侵引起的體溫升高、呼吸道感染等癥狀有明顯的改善作用。因此將其轉化為國家三類新獸藥(證書編號：(2018)新獸藥證字5號)[2]。魚腥草芩藍口服液申報制備工藝采用傳統水提醇沉除雜的工藝，酒精試劑用量大，成本相對較高。膜分離技術作為一種新興的綠色工業科學技術，集分離、濃縮、純化和精制功能于一體，且具有簡便易行、生產周期短、可重復性利用的優勢[3-5]，在中藥提取分離中應用日益增多，因此，本實驗采用膜分離技術，利用不同膜組件截留不同分子量的原理，采用微濾、超濾和納濾相結合的方式，對魚腥草芩藍水提液進行膜過濾除雜并進行膜濃縮，開展優化除雜工藝的實驗研究，并與傳統水提醇沉工藝進行比較，為該技術在魚腥草芩藍水提液除雜精制過程中應用的適用性提供參考，并為提取純化工藝的優化提供科研數據支持，為提升產品品質提供質量保障。

1 儀器與材料

1.1 儀器 多功能實驗室膜分離設備(紹興海納膜技術有限公司)，膜管材質孔徑分別為：PVDF微濾膜：孔徑 200 nm；PES超濾膜：孔徑50 kd、20 kd、10 kd、2.5 kd、1.5 kd、1 kd；復合膜納濾膜：孔徑 500 D；UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國 Thermo公司)，DAD檢測器，變色龍工作站； AUW120D 型電子天平(日本 SHIMADZU 公司)；101-1型電熱鼓風干燥箱(龍口市電爐制造廠)；ZSW-H250A藥品綜合穩定性試驗箱(偵翔機電科技(上海有限公司)。

1.2 試劑與對照品 綠原酸對照品(批號 110753-201415，含量96.2%)，黃芩苷對照品(批號 Z0271504，含量95.9%) 均購于中國獸醫藥品監察所。乙腈為色譜純；甲醇、磷酸、磺基水楊酸為分析純；娃哈哈水。

1.3 藥材 魚腥草、黃芩、板藍根、連翹、金銀花等藥材購于安國藥材市場，經本公司質控部鑒別均符合《中華人民共和國獸藥典》2015版(Ⅱ部)有關項下規定[6]。

2 方法與結果

2.1 魚腥草芩藍水提液的制備 按組方配比稱取各味藥材，加10倍量水，煎煮兩次，每次2 h，水煎液過濾，合并，作為魚腥草芩藍水提液，利用膜分離技術進行除雜、濃縮。

2.2 膜分離試驗 取樣品液置膜分離設備進料筒，開機，樣品液通過進料泵輸入膜分離組件，以錯流方式進行過濾，同時通過冷卻水循環機組對系統進行冷卻，以控制樣品液溫度。經膜分離后透過液從膜組件外側出口端流出，截留液返回進料筒中再次循環。待循環藥液體積較小，系統壓力不穩時，加入2 L水繼續過濾，至過濾完全，分別收集透過液及未透過液，分別測定有效成分含量。

2.3 綠原酸和黃芩苷含量測定 以綠原酸和黃芩苷含量為考察指標，通過HPLC法分別測定水提液、不同孔徑膜管透過液、不同截留分子量范圍藥液及魚腥草芩藍口服液中綠原酸、黃芩苷含量。綠原酸和黃芩苷含量測定梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.4 微濾、超濾、納濾膜孔徑初步篩選 在室溫條件下，取適量水提液，置膜分離設備進料筒，以200 nm濾膜微濾，分別收集透過液及未透過液，得魚腥草芩藍微濾液及大于200 nm藥液；取魚腥草芩藍微濾液，平均分成四份，其中一份減壓濃縮制備口服液得魚腥草芩藍口服液(200 nm)；剩余四份微濾液，于室溫條件下，置膜分離設備進料筒，分別在不同孔徑膜(50 kd、10 kd、2.5 kd)適用壓力范圍內進行濾過，分別收集不同孔徑膜透過液，觀察濾液性狀，測定綠原酸和黃芩苷含量，比較膜過濾前后各成分轉移率及固形物去除率的變化；并將透過液進行500 d納濾膜濃縮，濃縮液制備不同孔徑魚腥草芩藍口服液(200 nm、50 kd、10 kd、2.5 kd)，觀察口服液性狀并測定溶液中綠原酸和黃芩苷含量，分別對4種不同孔徑膜管進行比較，對魚腥草芩藍水提液膜過濾除雜分子量截留范圍進行初步篩選；納濾液分別收集，測定綠原酸和黃芩苷含量，對膜濃縮所用納濾膜孔徑進行初步考察，結果見圖1和表2～表4。

圖1 水提液過濾前后藥液澄清度Fig 1 The liquid clarification degree of water extraction before and after filtering

孔徑性狀濾過前濾過后綠原酸轉移率/%黃芩苷轉移率/%200 nm渾濁透明、澄清92.3689.1350 kd透明、澄清透明、澄清89.2187.2510 kd透明、澄清透明、澄清59.2329.142.5 kd透明、澄清透明、澄清13.562.87

轉移率(%)=濾過液中有效成分的量/水提液中有效成分的量*100%

表3 不同膜孔徑膜固形物去除率的比較Tab 3 The comparison of different membrane aperture membrane solids removal rate

固形物去除率(%)=(水提液固形物總量-濾液固形物總量)/水提液固形物總量*100%

表4 膜孔徑對魚腥草芩藍口服液制劑工藝的影響結果Tab 4 the effect of membrane pore diameter on the preparation technology of Yuxingcaoqinlan oral liquid

2.5 分子量截留范圍的深入考察 按確定組方及工藝進行提取，放冷至室溫，于室溫條件下，200 nm微濾后，依次通過不同孔徑濾膜(50 kd、20 kd、10 kd、2.5 kd、1.5 kd、1 kd)濾過，分別收集透過液及未透過液，得不同分子量截留范圍溶液(>200 nm、50 kd～200 nm、20 kd～50 kd、10 kd～20 kd、2.5 kd～10 kd、1.5 kd～2.5 kd、1 kd～1.5 kd、<1 kd)，分別測定不同截留分子量范圍內綠原酸、黃芩苷含量，計算兩種有效成分所占比例，以確定膜分離技術在魚腥草芩藍口服液應用時的分子量截留范圍。結果見表5和圖2。

表5 不同分子量范圍有效成分含量占比Tab 5 The radio of active component contents in different molecular weight range

圖2 不同分子量范圍有效成分含量占比圖Fig 2 The radio of active component contents in different molecular weight range

2.6 工藝驗證 按確定的工藝制備魚腥草芩藍水提液，三份，分別以200 nm濾膜微濾后，按確定的分子量截留范圍進行膜分離和膜濃縮，分離測定除雜前后藥液中黃芩苷和綠原酸含量，計算轉移率；濃縮液制備口服液，分別測定樣品中黃芩苷和綠原酸含量，對工藝的可行性進行考察。結果見表6。

表6 濾過前后藥液性狀及有效成分轉移率比較Tab 6 The comparison of transfer rate of effective component before and after filtration

轉移率(%)=濾過液中有效成分的量/水提液中有效成分的量*100%

2.7 不同工藝魚腥草芩藍口服液的制備及含量比較

2.7.1 膜分離技術 取微濾及不同孔徑超濾膜濃縮液，進一步減壓濃縮至適量，加入3 ‰苯甲酸鈉，攪勻，濾過，即得。

2.7.2 傳統水提醇沉工藝 按組方配比稱取各味藥材，加10倍量水，煎煮兩次，每次2 h，水煎液過濾，合并，濾液減壓濃縮置至適當相對密度的清膏，加乙醇至含醇量為70%，搖勻，靜置，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至適量，加入3 ‰苯甲酸鈉，攪勻，濾過，即得。

2.7.3 綠原酸和黃芩苷含量測定 按2.3項下方法，測定魚腥草芩藍口服液中綠原酸和黃芩苷的含量，結果見表7。

2.7.4 蛋白質檢測 取魚腥草芩藍口服液1 mL，加水稀釋至10 mL，取1 mL，加新配制的30%磺基水楊酸試液1 mL，混勻，放置5 min，觀察是否有渾濁出現。結果顯示：膜分離除雜工藝制備的樣品未出現渾濁，醇沉工藝制備的樣品有渾濁出現。

2.7.5 穩定性考察 按照《獸用中藥、天然藥物穩定性試驗技術指導原則》的規定及魚腥草芩藍口服液質量標準，對不同工藝制備的魚腥草芩藍口服液進行12個月長期穩定性(溫度25±2℃、相對濕度60±10%)和6個月加速穩定性(溫度30±2 ℃、相對濕度60±5%)考察，分別考察不同工藝樣品的穩定性。結果顯示：不同工藝制備的魚腥草芩藍口服液，穩定性均良好。

表7 不同工藝魚腥草芩藍口服液有效成分含量的比較(n=3)Tab 7 The comparison of effective component content between different process of Yuxingcaoqinlan oral liquids (n=3)

3 討論與結論

分離精制工藝是中藥復方口服液生產過程中一個極為關鍵的環節，膜分離是結合分離純化和濃縮為一體的新方法，具有分離度高、分離成分穩定、無污染、藥物純度理想等優點，在人用中藥精制液制劑的純化中應用較多[7-9]，在獸藥制劑中的研發卻鮮有報道，且目前尚未見有應用膜分離技術純化魚腥草芩藍制劑的的報道，鑒于此，研究團隊探討了膜分離技術純化魚腥草芩藍制劑的應用價值。

結合濾液性狀、固形物去除率、綠原酸和黃芩苷轉移率及對口服液劑型的影響5個指標，對3種不同孔徑超濾膜及200 nm微濾膜進行比較。結果發現魚腥草芩藍口服液水提液經4種不同孔徑膜濾過后，均可得到澄清、透明濾液。200 nm微濾膜有效成分轉移率最佳，但所濾液固形物去除率相對較差，因此所制備口服液性狀較差；其余3種孔徑超濾膜綠原酸和黃芩苷的轉移率隨著孔徑的增大而升高，固形物去除率隨著孔徑的增大而降低，且口服液性狀均較好，同文獻[10-12]研究結果類似。其中，孔徑50 kd超固形物去除率較高，綠原酸和黃芩苷轉移率最高，在85%以上，且明顯高于傳統水提醇沉工藝所制備樣品；2.5 kd和10 kd超濾膜綠原酸和黃芩苷轉移率轉移率相對較低，在60%以下，損失較多，因此，膜過濾孔徑初步篩選為50 kd。

膜分離技術的應用還體現在對不同分子量范圍成分的獲取及藥理活性研究[13-14]。陳彤[15]等采用截留相對分子量100 kd的聚醚砜膜對三七總皂苷進行分離純化。膜分離純化工藝研究文獻報道較多，但膜分離純化和膜濃縮工藝相結合的研究報道相對比較少。魚腥草芩藍口服液試驗過程中首次利用膜分離技術對魚腥草芩藍水提液進行分子量截留范圍的深入考察，試驗結果發現，魚腥草芩藍水提物中有效成分綠原酸集中在1.5 kd～20 kd之間，占比分別為76.94%；有效成分黃芩苷集中在2.5 kd～50 kd之間，占比分別為77.05%，均在75%以上，綜合考慮兩種成分的占比，確定優選截留分子量范圍可選擇為1.5 kd～50 kd。三批次驗證試驗表明，膜過濾工藝除雜后，藥液中綠原酸和黃芩苷轉移率均在70%以上，且所制備魚腥草芩藍中綠原酸和黃芩苷含量均比傳統醇沉工藝要高。對于不同分子量范圍所含成分的藥理活性的不同，有待于進一步研究。

黃芩苷和綠原酸分子量分別為446.35和354.31，均小于500，但在研究中發現，在水溶液中，采用截留分子量為500的膜過濾時，透過液中卻不存在黃芩苷和綠原酸成分，說明黃芩苷和綠原酸與其它成分之間可能是以類似于絡合物性質的“分子團”形式存在，其原因可能是中藥所含成分的復雜性導致各成分之間相互吸引而形成“分子團”。經研究發現綠原酸“分子團”的大小約為1.5 kd分子量，黃芩苷“分子團”的大小約為2.5 kd分子量，所以用膜分離純化采用的膜標稱分子量就不能與分子量接近，而應該通過試驗來摸索。

蛋白質、鞣質類成分是可能影響口服液制劑穩定性的常見物質。Kumar[16]將綠茶提取液通過孔徑0.2 μm的微濾膜，除去細胞碎片及大分子蛋白質。魚腥草芩藍口服液試驗過程中對蛋白質類成分進行了考察，結果顯示：膜分離除雜工藝制備的樣品進行蛋白質檢測時未出現渾濁，醇沉工藝制備的樣品有渾濁出現，說明膜分離除雜工藝確實過濾掉了絕大部分的蛋白質類無效成分；試驗過程中亦對鞣質類成分進行了考察，結果顯示：兩種工藝制備的魚腥草芩藍口服液中均有鞣質存在。鞣質的分子量為1701.22，而膜濃縮的分子量截留范圍為小于等于1.5 kd，考慮到有效成分的保留率，膜分離除雜工藝未能將魚腥草芩藍口服液中鞣質類成分去除掉。提示在以后的試驗研究中，在保證有效成分保留率的前提下，可以同時去除掉蛋白質、鞣質類可能影響制劑穩定性的物質，以保證口服液類制劑的穩定性。魚腥草芩藍口服液穩定性試驗研究結果顯示，不同工藝制備的樣品12個月長期穩定性和6個月加速穩定性均良好，12個月以上的長期穩定性試驗及臨床療效驗證試驗有待于進一步考察。

綜上所述，1.5 kd～50 kd截留分子量范圍內的超濾膜對魚腥草芩藍水提液濾過效果較好，且在口服液生產過程中可縮短生產流程、提高制劑的穩定性和安全性，對工業化生產和推廣具有指導意義。