蜘蛛香膠囊的質量標準研究

楊海峰，金禮琴，陳曉蘭，李鋒濤，李艷艷，吳 悅，李勇軍*

(1.江蘇農牧科技職業學院，泰州 225300；2. 江蘇中牧倍康藥業有限公司，泰州 225300)

蜘蛛香為敗醬科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根莖和根，其性味微苦、辛、溫，歸肺、脾、胃經，有理氣止痛、消食止瀉、祛風除濕之功效，主治肚腹脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風濕痹痛[1-3]。蜘蛛香主要含有揮發油、黃酮類、環烯醚萜類和多糖等化學成分[4]。現代藥理學研究表明，蜘蛛香提取物不僅具有鎮靜、催眠、鎮痛、雙向調節腸道蠕動等作用[5-7]，對細菌、病毒引起的腸炎也有較好的療效[8-9]。蜘蛛香膠囊為蜘蛛香藥材細粉制成的單方硬膠囊，于2017年1月獲得國家三類新獸藥證書，是目前國內獲批的中藥類寵物藥品，主要用于防治犬細小病毒性腸炎。試驗從性狀、鑒別、檢查、含量測定等方面開展了蜘蛛香膠囊的質量研究，建立了質量控制方法，為其臨床應用的有效性和安全性提供了實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC20A型高效液相色譜儀，配備SPD-20A紫外檢測器、LC-20AT雙泵、HT-220A柱溫箱，日本島津公司產品；UV-2250型紫外可見分光光度計，日本島津公司產品；AS1201型自動進樣器，大連依利特公司產品；BT25S型電子天平，北京賽多利斯公司產品。

1.2 試藥 蜘蛛香膠囊，規格0.25g/粒，批號分別為150826、150828、150830、150906、150908、150910，江蘇中牧倍康藥業有限公司提供；橙皮苷對照品，批號110721-201316，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為自制純化水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 性狀 蜘蛛香膠囊為蜘蛛香藥材細粉制成的硬膠囊，內容物為灰棕色或棕色的顆粒和粉末；氣特異，味微苦、辛。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 取蜘蛛香膠囊內容物，置顯微鏡下觀察。顯微鑒別特征明顯，可見淀粉粒甚多，單粒類圓形、長圓形或卵形，有的一端尖突，直徑5～39 μm，臍點裂縫狀、三叉狀或點狀，有的可見層紋；復粒由2～4粒組成。導管主為網狀導管和單紋孔導管。薄壁細胞內含有淡棕褐色物和橙皮苷結晶。

2.2.2 薄層色譜鑒別 取蜘蛛香膠囊內容物0.2 g，加乙醚5 mL，振搖，放置5 min，濾過，濾液揮去乙醚，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取蜘蛛香對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。吸取供試品溶液5 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚-丙酮(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。薄層色譜圖見圖1，可見斑點清晰，供試品、對照藥材及對照品在相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，說明TLC法能鑒別出橙皮苷。

(1.橙皮苷對照品；2.蜘蛛香對照藥材；3.蜘蛛香膠囊供試品)(1. reference substance of hesperidin；2. reference drug of Valeriana jatamansi Jones reference；3. ested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule)圖1 橙皮苷的薄層色譜圖Fig 1 The TLC chromatogram of hesperidin

2.3 檢查

2.3.1 水分 采用烘干法測定蜘蛛香膠囊的水分，準確稱取3批次蜘蛛香膠囊內容物2 g，平鋪于已干燥恒重的稱量瓶中，精密稱定，置105 ℃干燥至恒重。根據減失的重量，測得3批次蜘蛛香膠囊的水分含量分別為6.8%、7.1%、6.5%，均低于9%，符合規定。

2.3.2 裝量差異 取蜘蛛香膠囊10粒，分別精密稱定重量，傾出內容物，囊殼用小刷拭凈，再分別精密稱定囊殼重量，計算每粒內容物的裝量與平均裝量。3批次蜘蛛香膠囊的平均裝量(n=10)分別為0.2503 g(RSD=2.7%)、0.2530 g(RSD=3.5%)、0.2515 g(RSD=2.4%)，裝量差異在標示裝量的±10%以內，符合規定。

2.3.3 崩解時限 取蜘蛛香膠囊6粒，采用升降式崩解儀測定其崩解時限。3批次蜘蛛香膠囊的崩解時間分別為15、16、15 min，均在30 min之內崩解，符合規定。

2.3.4 微生物限度 按照非無菌產品，采用微生物計數法和控制菌檢查法進行微生物限度檢查。供試液制備方法如下：取蜘蛛香膠囊內容物10 g置入滅菌研缽中，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液至20 mL，置45 ℃水浴中，振蕩，使溶解，充分研磨，并在研磨過程中逐漸增加稀釋液，直至供試品完全呈細勻狀態為止，稀釋液加入至總量為100 mL，作為1∶10的供試液。測定3批次蜘蛛香膠囊的細菌總數分別為74 cfu/g、67 cfu/g、61 cfu/g，霉菌和酵母菌總數分別為23 cfu/g、28 cfu/g、25 cfu/g，未檢出大腸埃希菌，微生物限度檢查結果符合規定。

2.4 含量測定

2.4.1 對照品溶液制備 精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度為40 μg/mL的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液制備 取蜘蛛香膠囊內容物，研細，分別取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.3 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)；檢測波長：284 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 繆L。在上述色譜條件下，橙皮苷與供試品溶液中的其他組分分離度良好，其保留時間在14.6 min左右，見圖2。

2.4.4 線性關系考察 精密稱取橙皮苷對照品20 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液0.5、1、2、5、10、20 mL，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成8、16、32、80、160、320 g/mL系列濃度的對照品溶液。精密吸取上述不同濃度的對照品溶液20 μL，分別進樣，測定峰面積。以峰面積(Y)對橙皮苷質量(X)進行線性回歸，得回歸方程Y=1906206.20X+102959.48(r=0.9999)，橙皮苷進樣量在0.16～6.4 μg范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取20 μL同一橙皮苷對照品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，結果橙皮苷對照品溶液峰面積的RSD為0.43%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗 取蜘蛛香膠囊內容物約0.5 g，精密稱定，按“2.4.2”項下制備供試品溶液，分別于配制后0、1、3、6、12、24 h，按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定，測定峰面積。結果同一供試品溶液在不同時間點所測得的橙皮苷峰面積的RSD為1.7%(n=6)，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.7 重復性試驗 取同一批號的蜘蛛香膠囊內容物6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定。測得同一批次蜘蛛香膠囊中橙皮苷的平均含量為2.11 mg/粒，RSD為1.9%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取同一批號已知橙皮苷含量的蜘蛛香膠囊內容物6份，每份約0.5 g，精密稱定，每份分別精密加入橙皮苷對照品溶液20 mL(0.2005 mg/mL)，按“2.4.2”項下制備供試品溶液，并按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定。加樣回收率試驗結果見表1，橙皮苷的平均回收率為97.7%，RSD為1.3%(n=6)，表明該方法準確性良好。

(A.橙皮苷對照品；B.蜘蛛香膠囊供試品；1. 橙皮苷)(A.reference substance of hesperidin; B. tested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule; 1. hesperidin)圖2 橙皮苷的高效液相色譜圖Fig 2 The HPLC chromatogram of hesperidin

樣品編號樣品重量樣品含量加入量測得總量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.50074.19524.018.165099.020.49974.19744.018.032395.630.50014.19284.018.121397.940.50054.20094.018.142798.350.50034.19334.018.157598.960.49954.19874.018.077396.797.71.3

2.4.9 樣品含量測定 取不同批次的蜘蛛香膠囊內容物，每批取3份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.4.2”項下制備供試品溶液，并按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定，測得峰面積，用外標法計算出橙皮苷含量，并換算成每粒蜘蛛香膠囊中所含的橙皮苷含量。6批次蜘蛛香膠囊的橙皮苷含量測定結果見表2，橙皮苷平均含量為2.08 mg/粒。

表2 蜘蛛香膠囊中橙皮苷的含量測定結果Tab 2 The determination of hesperidin in tested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule

3 討論與結論

目前中藥質量控制的方法是其活性成分的定性與定量分析。橙皮苷(hesperidin)是蜘蛛香的主要化學成分之一，含量高，穩定性好，可作為蜘蛛香質量控制的監測指標。鑒別試驗中，采用了獸藥典普遍采用的顯微鑒別和薄層色譜鑒別，其鑒別操作簡單、特征明顯，專屬性強，重現性好。對水分、裝量差異、崩解時限、微生物限度等檢查項目進行方法驗證和測定，檢查結果均符合我國獸藥典的相關規定。參考文獻報道的蜘蛛香藥材中橙皮苷HPLC檢測方法[10-12]，分別選擇了乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶80)、乙腈：水(15∶85)、甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)、乙腈-2%醋酸溶液(18∶82)等幾種不同組成及不同比例的流動相進行了考察，結果顯示以甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)作為流動相獲得的色譜峰峰形較好，橙皮苷的分離效果最好。

6個不同批次的蜘蛛香膠囊中橙皮苷(C28H34O15)的平均含量為2.08 mg/粒，考慮不同產地蜘蛛香藥材中橙皮苷含量的差異，以含量測定值的80%作為含量下限，本品每粒含蜘蛛香以橙皮苷(C28H34O15)計，不得少于1.66 mg。綜上所述，所建立的蜘蛛香膠囊質量控制方法專屬性強、重復性好，能準確的進行定性和定量檢測，可作為其生產、檢驗、使用和監管的技術依據。