豚鼠精囊Cajal間質細胞的鑒定*

王江平，王勤章，焦 勇，許志斌△

1.空軍軍醫大學唐都醫院泌尿外科(西安 710038)，2.石河子大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科(石河子 832000)

主題詞 Cajal間質細胞 精囊 受體蛋白質酪氨酸激酶 神經 肌細胞,平滑肌 細胞結構

西班牙神經解剖學家Cajal于1911年首次發現了一種特殊類型的胃腸道間質細胞，后來這種細胞被命名為Cajal間質細胞(Interstitial cells of cajal，ICC)。ICC逐漸被證實為胃腸道平滑肌自主收縮的起搏細胞，并作為“中轉站”介導自主神經信號至平滑肌，調控平滑肌活動[1-2]。近二十年來，在膀胱、前列腺和尿道等組織陸續發現了ICC，研究發現這些ICC也發揮類似消化道ICC的作用，在相應組織平滑肌的活動中發揮重要作用[3-6]。精囊是男性生殖系統的重要腺體，精囊平滑肌可以自主收縮并接受神經信號的調控，參與射精等功能。精囊平滑肌的這些生理特征與消化和泌尿系統平滑肌非常相似，同時由于生殖系統和泌尿系統都起源于胚胎的中胚層，所以在精囊中很可能存在ICC。消化和泌尿系統ICC都表達特異的標記性抗原—酪氨酸激酶受體c-Kit，并具有典型的超微結構特征。本研究利用免疫熒光染色和透射電鏡首次發現在豚鼠精囊腺中存在ICC，現報告如下。

材料與方法

1 材 料 體重350～500 g的成年雄性豚鼠5只。大鼠抗小鼠c-Kit抗體(1∶200)，購自美國Millipore；兔抗小鼠α-actin抗體(1∶400)，購自美國Abcam；兔抗小鼠神經元特異性烯醇化酶 (Neuron-specific enolase，NSE)抗體(1∶200)，購自美國Santa Cruz；FITC 標記的羊抗大鼠抗體(1∶200)，購自北京中杉金橋；TRITC標記的羊抗兔抗體(1∶200)，購自北京中杉金橋。

2 方 法

2.1 免疫熒光染色實驗：腹腔內注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉將雄性豚鼠麻醉后處死，立即解剖、取出精囊組織；使用OCT將精囊組織包埋，冰凍切片機制作20 μm切片，貼附于載玻片上，在4℃丙酮中浸泡15 min；用1∶100胎牛血清封閉，孵育80 min，分別滴加c-Kit抗體和α-actin抗體混合液，c-Kit抗體和NSE抗體混合液，在4℃環境中孵育12 h；加FITC和TRITC標記的二抗，置于25℃濕盒內避光孵育60 min；封片后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，FITC激發波長為488 nm，TRITC為543 nm，使用Zeiss LSM 軟件保存、分析圖片。

2.2 透射電鏡觀察實驗：修整精囊組織邊緣，切割成約2 mm3大小的組織塊；置于3%戊二醛固定液中持續固定48 h，將固定后的組織塊置入0.1%鋨酸中固定2 h后移至1%的醋酸鈾內，室溫下染色2 h；將組織塊脫水后浸泡在丙酮、中性樹膠的混合液中，37℃烘箱內過夜；在超薄切片機上沿標本水平面切割制作2 μm的組織切片，使用甲苯藍染色，置于顯微鏡下進行定位；在超薄切片機上切割100 nm的超薄組織切片，進行雙重電子染色，飽和醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色15 min；將切片置于透射電鏡下觀察并拍片。

結 果

1 免疫熒光染色實驗結果 在豚鼠精囊內發現大量的c-Kit 陽性細胞(圖 1)，按照組織分布可以分為兩種，一種位于精囊壁肌層的平滑肌細胞之間，另一種分布于精囊腔內蜂窩狀黏膜褶皺的間質中(圖 1A，1B，1C)。這些c-Kit陽性細胞和胃腸道ICC的一般形態學特征相似，細胞呈紡錘形(圖 2A，2B)或星形(圖 2C)，胞體約20μm，細胞兩端有明顯細長的突起，細胞漿染色，少量細胞漿包繞在細胞核周圍，細胞核大，呈橢圓形，位于細胞中央，占細胞2/3以上體積且未被c-Kit抗體標記、染色(圖 2A，2B)。ICC肌動蛋白染色陰性(圖 2A)，總是與平滑肌組織內的神經纖維平行分布并密切接觸(圖 2C，2D)，并且精囊壁ICC與平滑肌細胞也密切接觸(圖 2A)。

A，B，C：c-Kit陽性ICC(綠色，黃色箭頭)位于平滑肌束(紅色)內；c-Kit陽性ICC(綠色，白色箭頭)位于精囊黏膜褶皺間質內

圖1 豚鼠精囊組織內c-Kit陽性ICC的分布

A: 免疫熒光雙染顯示c-Kit陽性ICC(綠色)和α-actin陽性平滑肌細胞緊密相鄰(白色箭頭)。B: 高倍鏡下的c-Kit陽性ICC(綠色)。C，D： 免疫熒光雙染顯示c-Kit陽性ICC(綠色)和 NSE陽性神經纖維緊密接觸(白色箭頭)

圖2 豚鼠精囊內ICC與神經纖維及平滑肌細胞之間的關系

2 透射電鏡實驗結果 透射電鏡下發現豚鼠精囊壁平滑肌細胞間和囊腔黏膜皺襞間質內存在大量類似于胃腸道ICC的特殊間質細胞，梭型或星形，細胞核呈橢圓形，體積較大，染色質邊聚，少量胞漿圍繞細胞核分布(圖 3A)，胞漿內見較多的線粒體、粗面內質網，細胞內無肌纖維，細胞膜周圍可見不連續的基膜(圖 3B)，少量膜陷小穴(caveolae)沿細胞膜排列(圖 3A)，胞體常形成2個或多個細長的細胞突起，ICC之間可以通過細胞突起相互連接(圖 3A)，上述超微結構特點符合ICC的超微結構鑒定標準。精囊壁及黏膜皺褶間質內無髓鞘神經纖維輪廓內可見神經絲以及少量線粒體(圖 3A)。精囊ICC與相鄰的神經末梢形成密切的接觸，ICC伸出細長的突起并延伸至平滑肌細胞之間，和平滑肌細胞緊密相鄰(圖 3A)。

A：精囊ICC位于平滑肌細胞(SMC)之間，和神經纖維(白色箭頭)密切接觸，ICC通過細胞膜與臨近另一個ICC(白色三角)的細胞突起密切接觸，其另外一端細長的細胞突起深入平滑肌細胞之間。 ICC細胞膜上可見少量的膜陷小泡(黑色箭頭)。 B：高倍鏡視野可見ICC胞漿內含有大量粗面內質網(黑色箭頭)和線粒體(白色箭頭)

圖3 豚鼠精囊ICC的超微結構

討 論

以往消化道ICC的發現，對研究胃腸道平滑肌自主及神經調控活動具有里程碑式的意義。雖然后來在胃腸道以外的許多組織也被證實存在ICC并發揮重要的生理功能，但在精囊腺中尚未見發現ICC的報道。

c-Kit為一種受體性酪氨酸蛋白激酶，表達于ICC細胞膜上和細胞漿內，與干細胞刺激因子結合后通過不同途徑引起ICC增生和分化并和ICC多種生理功能相關。c-Kit是ICC上一種特異性的抗原，為鑒定各系統ICC提供了一種可靠的工具，目前采用c-Kit抗體標記的免疫化學法已經成為鑒定ICC的“金標準”[4-7]。通常認為只要c-Kit陽性細胞為梭型或星形，具有兩個或多個細胞突起，和神經纖維及平滑肌細胞聯系緊密，那么這些c-Kit陽性細胞就可被認定為ICC[4-7]。本研究使用c-Kit抗體在豚鼠精囊組織內標記出大量的c-Kit陽性細胞，并且這些細胞符合ICC的上述一般形態特征，和神經纖維及平滑肌細胞聯系緊密，所以我們將這些c-Kit陽性細胞認定為精囊ICC。另外，盡管肥大細胞也可以表達少量的c-Kit，但是其呈典型的圓形，沒有明顯的細胞突起，且細胞體積較大，明顯區別于這些精囊ICC。

在使用c-Kit抗體標記的免疫組化法成為鑒定ICC的“金標準”之前，透射電鏡下細胞超微結構觀察是鑒定ICC的首選方法[8]。目前確認ICC的超微結構特點有：細胞呈典型的梭型或星形，胞體約20 μm大小，細胞核呈橢圓形，占細胞的2/3以上，大量線粒體，大量粗面內質網，膜陷小穴，不完整的細胞基膜，細胞內不含肌動蛋白等[7]。本實驗通過透射電鏡觀察發現在豚鼠精囊壁平滑肌細胞之間和精囊腔黏膜皺褶的間質內存在一種特殊的間質細胞，這些細胞具有上述ICC的超微結構特點，和組織免疫熒光染色標記的c-Kit陽性細胞解剖定位、一般形態及細胞核漿比例等形態學特點高度一致，并且也和神經纖維及周圍的平滑肌細胞關系密切，所以我們結合兩種觀察結果確定這些特殊的間質細胞為精囊ICC。

胃腸道ICC為平滑肌慢波的起搏細胞，控制著胃腸道活動的基本節律，同時作為“中轉站”，介導胃腸道神經信號，調控平滑肌活動[1-2]。ICC發揮上述功能的結構基礎就是ICC和神經、平滑肌細胞具有密切的形態學聯系。本研究通過免疫熒光染色及透射電鏡發現豚鼠精囊ICC和神經纖維以及平滑肌細胞之間聯系緊密，電鏡下觀察到相鄰的精囊ICC常借助突起互相連接，這些細長的突起還延伸入平滑肌細胞之間，所以我們初步推測精囊ICC和平滑肌活動密切相關，可能像胃腸道及膀胱、前列腺ICC一樣充當精囊平滑肌自主活動的起搏器以及神經信號調控平滑肌活動的“中轉站”，參與精囊射精等活動。腸道、膀胱ICC還具有感受張力刺激的作用，在張力作用下ICC產生起搏信號或者將張力信號上傳。正常性欲的維持與精囊內的張力有關[9-10]，在精囊蜂窩狀黏膜皺褶內中幾乎沒有平滑肌細胞存在，黏膜皺褶間質中的 ICC和神經元纖維聯系緊密，我們推測其可能通過某種機制感受精囊腔內張力刺激并轉化為神經信號上傳，從而參與雄性性欲的產生和維持。

綜上所述，我們通過免疫熒光標記和透射電鏡首次在豚鼠精囊壁平滑肌細胞間及精囊腔黏膜皺褶間質內發現大量的特殊間質細胞，這些細胞表達ICC特異性抗原c-Kit，符合ICC超微結構特征，和神經纖維及平滑肌細胞關系密切，可能發揮著類似ICC的生理作用。