hTERC基因在子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)及臨床意義*

符麗華，欒 峰，米賢軍，羅小婉，高子軒，陳 昂，代新珍

廣東省中山市博愛(ài)醫(yī)院 (中山 528402)

主題詞 子宮內(nèi)膜腫瘤 子宮內(nèi)膜增生 基因表達(dá)調(diào)控, 腫瘤 @人類染色體端粒酶基因

子宮內(nèi)膜病變是普遍的婦科疾病,而內(nèi)膜癌是婦科較常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)子宮內(nèi)膜早期病變甚至在癌癥預(yù)后判斷尚沒(méi)有較明確方法手段。研究表明惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因調(diào)控失常，細(xì)胞異常增殖有關(guān)，人類染色體端粒酶RNA(Human telomerase gene,hTERC)由Feng等[1]于1995年首次從腎癌293細(xì)胞系cDNA文庫(kù)中篩選出，hTERC基因的突變可導(dǎo)致端粒酶活性降低和端粒縮短，端粒酶基因擴(kuò)增是癌變的常見(jiàn)現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)端粒酶異常與宮頸癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但在子宮內(nèi)膜癌研究不多。本文研究hTERC在子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)情況，探討hTERC在子宮內(nèi)膜病變發(fā)生發(fā)展中的意義，為臨床探索子宮內(nèi)膜癌早期診斷和預(yù)后提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 收集2015年至2016年南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛(ài)醫(yī)院病理科正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生癥(單純型增生、復(fù)雜型增生、不典型增生)及子宮內(nèi)膜癌組織石蠟切片各25例，共125例標(biāo)本行hTERC基因FISH檢測(cè)。正常子宮內(nèi)膜組織年齡23～53歲，平均37.3歲；單純型增生組年齡38～55歲，平均45.92歲；復(fù)雜型增生組年齡27～57歲，平均41.16歲；不典型增生組年齡35～63歲，平均48.76歲。子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期(FIGO，2009年)標(biāo)準(zhǔn)：I期18例,II期2例,III期3例,IV期2例；高分化腺癌9例，中分化腺癌8例，低分化腺癌8例，患者年齡29～67歲，平均51.04歲。所有病例術(shù)前未接受任何治療，臨床病歷資料完整。

2 研究方法

2.1 病理組織制片。①標(biāo)本制作：手術(shù)或診刮的子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本常規(guī)固定石蠟包埋，切片HE染色，惡性腫瘤加做免疫組化確診；②診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2010年WHO女性生殖系統(tǒng)組織學(xué)分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，取典型病灶的子宮內(nèi)膜石蠟包埋組織標(biāo)本切片2 μm共3張組織玻片，70℃過(guò)夜烘烤，備做FISH檢驗(yàn)。

2.2 FISH檢測(cè)[2]。①北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供GLP TERC/CSP3 DNA探針、CSP3對(duì)照探針，標(biāo)記顏色,綠/紅。②標(biāo)本預(yù)處理：脫蠟：室溫將玻片置于二甲苯10 min脫蠟2次后浸入100%乙醇5 min；復(fù)水：將玻片各2 min依次浸入100%、85%和70%的乙醇后浸入去離子水中3 min后滅菌純化水90℃水浴20～30 min。松解、消化：將組織切片浸泡在0.2 ml蛋白酶K儲(chǔ)存液(20mg/ml)溶于40ml 2×SSC(pH 7.0)得到蛋白酶K工作液(100 μg/ml)中37℃孵育5～30 min。消化后于2×SSC溶液每次5 min漂洗2次,甲醛固定液中固定10 min后將玻片依次置于70%、85%和100%乙醇中各脫水2 min，自然干燥玻片。③FISH操作步驟：雜交液震蕩混勻，離心后雜交：將10 μl 探針混合物滴在玻片雜交區(qū)，蓋蓋玻片后封邊。將玻片放在雜交儀上83℃變性5 min，42℃復(fù)性16 h。洗滌：取出玻片移去蓋玻片, 玻片放入47℃ 2×SSC中洗滌10 min，放入47℃0.1%NP-40/2×SSC洗滌5 min，浸泡在70%乙醇中脫水3 min，自然干燥玻片；觀察：滴加15 μl DAPI復(fù)染劑到載玻片的組織中, 蓋上蓋玻片后在熒光顯微鏡濾光片下進(jìn)行觀察。75%以上癌細(xì)胞核中都有雜交信號(hào)為滿意標(biāo)本，在100×物鏡下觀察癌細(xì)胞核的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)和比值計(jì)算。所有完成雜交的玻片置于-20℃避光儲(chǔ)存。

2.3 FISH結(jié)果判斷。對(duì)照探針CSP3 DNA雜交到3號(hào)染色體著絲粒3p11.1-q11.1，綠色熒光信號(hào)，檢測(cè)探針TERC雜交到3號(hào)染色體3q26.3位點(diǎn)，紅色熒光信號(hào)。經(jīng)過(guò)FISH圖像分析軟件分析OLYMPUS BX51熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/TexasRed三色濾光鏡激發(fā)下，細(xì)胞hTERC基因探針在3號(hào)染色體著絲粒雜交情況，觀察GLP TERC/CSP3基因雙色雜交結(jié)果。計(jì)數(shù)細(xì)胞必須是各通道信號(hào)均清晰可辨的細(xì)胞，每例樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算顯示異常信號(hào)細(xì)胞數(shù)所占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比。雜交結(jié)果標(biāo)記顏色綠：紅；正常信號(hào)細(xì)胞為綠色及紅色信號(hào)各2個(gè)，即2:2；擴(kuò)增異常信號(hào)細(xì)胞為綠色信號(hào)≥2個(gè)，紅色信號(hào)>2個(gè)，統(tǒng)計(jì)TERC紅色信號(hào)≥3個(gè)信號(hào)點(diǎn)的百分比。

2.4 閾值建立。通過(guò)FISH檢測(cè)20例正常子宮內(nèi)膜石蠟包埋組織切片hTERC基因表達(dá)情況，分析100個(gè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞，計(jì)算異常hTERC基因信號(hào)百分比，按平均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差算出閾值，通過(guò)計(jì)算閾值=5.91%，即異常細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)≥6 則判斷為hTERC基因有擴(kuò)增，結(jié)果為陽(yáng)性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析，率的比較用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

子宮內(nèi)膜正常組、子宮內(nèi)膜單純型增生組、子宮內(nèi)膜復(fù)雜型增生組、子宮內(nèi)膜不典型增生組及子宮內(nèi)膜癌組織中hTERC基因陽(yáng)性表達(dá)率分別為20% (5/25)、52% (13/25)、28% (7/25)、20% (5/25)、36 % (9/25 )，子宮內(nèi)膜單純性增生陽(yáng)性率高于正常組和不典型增生組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(χ2=5.5556,P=0.0184),見(jiàn)表1。子宮內(nèi)膜癌組陽(yáng)性率高于子宮內(nèi)膜正常組，但經(jīng)檢驗(yàn)兩組hTERC基因擴(kuò)增陽(yáng)性率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.5873,P=0.2077) 。按子宮內(nèi)膜癌臨床分期，I / II期hTERC基因陽(yáng)性率為40% (8/20 )、III /IV期20% (1/4 )，雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)差別沒(méi)有意義(P=0.6206),但臨床觀察hTERC基因在早期臨床期別有高陽(yáng)性擴(kuò)增。按子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞分化程度，高分化hTERC基因陽(yáng)性率22.22% (2/9)、中分化50% (4/8)、低分化37.5% (3/8),TERC基因隨著腺癌分化程度越差擴(kuò)增陽(yáng)性率增高，但經(jīng)Fisher檢驗(yàn)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.5165)。本研究通過(guò)FISH檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織hTERC基因表達(dá)情況得出，子宮內(nèi)膜單純性增生陽(yáng)性率最高，子宮內(nèi)膜癌患者較正常子宮內(nèi)膜組織hTERC基因有擴(kuò)增并隨著癌細(xì)胞分化程度越低hTERC基因陽(yáng)性擴(kuò)增增加，表示子宮內(nèi)膜惡性病變可能與hTERC表達(dá)異常相關(guān)。

表1 hTERC基因與子宮內(nèi)膜病變的關(guān)系[例(%)]

討 論

端粒是維護(hù)真核細(xì)胞染色體穩(wěn)定性，細(xì)胞通過(guò)端粒酶合成端粒彌補(bǔ)染色體消耗的端粒，而端粒酶相關(guān)基因突變導(dǎo)致端粒酶活性下降端粒縮短，將引起細(xì)胞凋亡甚至惡變。研究表明一些腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)端粒酶基因擴(kuò)增是癌細(xì)胞增殖重要原因， hTERC基因擴(kuò)增對(duì)端粒酶激活和癌變進(jìn)展有促進(jìn)作用[3]。在人類85%～90% 的癌細(xì)胞中出現(xiàn)端粒酶基因的激活[3]，端粒酶的激活是細(xì)胞惡化過(guò)程中的其中一個(gè)關(guān)鍵步驟，而端粒酶重要組成部分是位于 3號(hào)染色體長(zhǎng)臂的人類染色體端粒酶RNA(hTERC)基因，hTERC基因的突變可導(dǎo)致端粒酶活性降低和端粒縮短，hTERC基因擴(kuò)增與腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)[4-5]。國(guó)內(nèi)外對(duì)hTERC與婦科腫瘤方面的相關(guān)研究多見(jiàn)于宮頸癌[6-10]，認(rèn)為宮頸癌變與hTERC基因擴(kuò)增相關(guān)，在子宮內(nèi)膜癌中探討極少。對(duì)子宮內(nèi)膜癌研究較多的是ER、PR、Ki67、CA125等表達(dá)[11-12]，認(rèn)為ER、PR、Ki67、CA125表達(dá)上調(diào)與子宮內(nèi)膜組織癌變、手術(shù)病理分期、組織分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。段清等[13]研究在子宮內(nèi)膜癌變過(guò)程中，hTERCmRNA表達(dá)上調(diào)、ASPP2 mRNA表達(dá)下調(diào)或缺失，二者有助于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷和預(yù)后判斷。但目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)子宮內(nèi)膜早期病變至癌變過(guò)程，hTERC基因如何變化，可否預(yù)測(cè)早期內(nèi)膜病變研究較少，基于此，本研究通過(guò)FISH技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織的hTERC基因表達(dá)情況，得出在子宮內(nèi)膜異常增生早期、內(nèi)膜癌癥和腫瘤細(xì)胞分化不良時(shí)hTERC有升高趨勢(shì)，hTERC的擴(kuò)增預(yù)示子宮內(nèi)膜有發(fā)生異常增生和癌變的傾向。在觀察隨訪所有患者，發(fā)現(xiàn)1例正常內(nèi)膜組織hTERC基因信號(hào)百分比高的患者，3個(gè)月后再次診刮發(fā)展成單純性增生，而1例hTERC基因陽(yáng)性的患者3個(gè)月后再次診刮仍為復(fù)雜性增生，而其它非手術(shù)治療hTERC基因陰性的患者復(fù)診正常，這提示hTERC基因擴(kuò)增預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜病變的高風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后不良。hTERC基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展起重要作用，為子宮內(nèi)膜病變患者提供更好的診治方案及病情監(jiān)控，有助于子宮內(nèi)膜病變的早期診斷和預(yù)后判斷，有助于監(jiān)測(cè)患者病情及治療方案。