Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3在腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義

李衛峰

成都三六三醫院病理科(成都 610041)

主題詞 神經膠質瘤 基因表達調控 基因,Bcl-2 @Ki-67 @Bax @Caspase-3

膠質瘤屬于一種原發惡性腫瘤，在人類神經系統極為常見，患者具有較高的病死率，發生這一現象的原因為受到膠質瘤侵入性生長方式的直接而深刻的影響[1]。Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤具有較為緩慢的生長速度、較長的病程，但是術后具有較高的復發率，而Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤則具有較快的生長速度、較短的病程，同時瘤體占位性效應會導致患者癲癇、嘔吐等的發生[2]。膠質瘤具有較為復雜的起病機制，通常情況下受到多種因素的直接而深刻的影響。近年來，臨床檢查并確診膠質瘤的速度在飛速發展的醫療技術的作用下日益加快[3]。本研究探討了Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3在腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義，現報道如下。

資料與方法

1 一般資料 隨機選取2015年5月至2017年5月我院收治的腦膠質瘤患者130例，納入標準：所有患者均經病理證實為腦膠質瘤，均經外科手術將膠質瘤標本切除；排除標準：缺乏完整病歷資料、手術前接受放化療治療等。其中男68例，女62例，年齡23～68歲，平均(45.2±7.6)歲。病理分級按照2016年WHO顱腦腫瘤的分類標準，進行病理組織學評估：I～II級68例，38例為少枝膠質細胞瘤，30例為星形細胞瘤。III～IV級62例，24例為膠質母細胞瘤，20例為髓母細胞瘤，18例為間變性星形細胞瘤。將WHO I～II級歸為低級別膠質瘤組，WHO III～IV級歸為高級別膠質瘤組。另選取同期我院收治的因腦出血或外傷進行顱內減壓的患者36例作為對照組，經外科手術將正常腦組織標本切除，其中男20例，女16例，年齡24～68歲，平均(46.7±7.2)歲。兩組患者一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法 用4%中性甲醛將兩組標本固定，脫水后石蠟包埋，采用德國Leica公司生產的石蠟切片機連續切片石蠟組織標本，厚度為5 μm，脫蠟后EDTA抗原修復，將內源性過氧化物酶消除掉，在此過程中將3%雙氧水充分利用，血清進行1 h的封閉后分別將美國Abcam公司生產的1∶100 Ki-67兔抗人單克隆抗體、1∶250 Bcl-2兔抗人單克隆抗體、1∶100 Bax兔抗人單克隆抗體和1∶100 Caspase-3兔抗人單克隆抗體一抗滴加其中，在4℃的溫度下孵育過夜，然后對其進行清洗，在此過程中將PBS充分利用，之后將過氧化物酶滴加其中對二抗進行標記，室溫下進行1 h的孵育。應用北京中杉金橋生物技術有限公司生產的DAB試劑盒DAB顯色、沖洗，對細胞核進行復染，在此過程中將蘇木精充分利用，常規脫水、透明、封片，在此過程中分別將梯度乙醇、二甲苯、中性樹膠充分利用。將一抗用PBS液取代掉作為陰性對照。

3 陽性結果判定標準 如果有棕黃色著色出現在細胞核中，則評定為Ki-67陽性；如果有黃色顆粒出現在細胞質與細胞核中，則評定為Bcl-2陽性；如果有棕黃色顯色出現在細胞質中，則評定為Bax陽性；如果有棕黃色顆粒出現在細胞質中，則評定為Caspase-3陽性。日本Nikon倒置相差光學顯微鏡下觀察標本，運用雙盲法判定結果。每張切片隨機觀察10個高倍鏡視野，計數100個膠質瘤細胞中陽性細胞數目，根據胞漿染色強度和陽性細胞百分比評定[4]。胞漿染色強度：無染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，深棕色計3分。陽性細胞百分比：無染色細胞為0分，染色細胞≤25%為1分，染色細胞26%～50%為2分，染色細胞>50%為3分。上述兩項相乘，按乘積分4級：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～5分為中等陽性()，≥6分為強陽性(，陽性包括(+)、()、()。

4 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件，兩組患者的Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達情況等計數資料用率表示，用χ2檢驗，其和膠質瘤惡性程度的相關性用Spearman法分析，檢驗水準α=0.05。

結 果

1 兩組患者Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達情況比較 見表1。腦膠質瘤組織中高級別膠質瘤組、低級別膠質瘤組的Ki-67、Bcl-2、Caspase-3表達陽性率均顯著高于對照組(P<0.05)，Bax表達陽性率均顯著低于對照組(P<0.05)，而高級別膠質瘤組的Ki-67、Bcl-2表達陽性率又均顯著高于低級別膠質瘤組(P<0.05)，Bax、Caspase-3表達陽性率又均顯著低于低級別膠質瘤患組(P<0.05)。

表1 Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3在兩組患者的表達情況比較 [例(%)]

注：與同組低級別膠質瘤組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05

2 Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達與臨床特征的關系 Ki-67、Bcl-2表達水平和膠質瘤惡性程度均呈顯著的正相關關系(r=0.608,0.711,P<0.05)，Bax、Caspase-3表達水平和膠質瘤惡性程度均呈顯著的負相關關系(r=-0.711,-0.362,P<0.05)。

討 論

Ki-67屬于一種非組蛋白性核內蛋白，在增殖細胞核中存在，從淋巴瘤L428細胞系中被發現，在人類10號染色體長臂上定位，組成成分為兩條多肽鏈，分子量分別為395 kD、345 kD，在近核仁區分布，能夠將S期、G1晚期、G2/M期細胞核抗原識別出來，但是由于G0期、G1早期細胞處于靜息狀態，因此其不具有該抗原。基于此，通常情況下，在對細胞增殖進行判斷的過程中，臨床將其作為標記蛋白。同時，很多相關醫學研究表明[5-7]，Ki-67能夠將腫瘤增殖率可靠而迅速地反映出來，和多種腫瘤的發生、進展、轉移及預后均具有極為密切的關系。

近年來，在不斷深入的膠質瘤研究的作用下，人們發現Bcl-2、Bax蛋白和細胞凋亡具有極為密切的關系，其主要在細胞質中分布。Bcl-2屬于一種凋亡抑制因子，是一種原癌基因，分離主體為淋巴瘤，在人類染色體18a21上定位，而Bax屬于一種凋亡誘導因子，在人類染色體19q13上定位，其蛋白主要在細胞質中存在。Bax在受到凋亡信號刺激后會從細胞質向線粒體轉移，然后作用于線粒體膜上的Bcl-2，從而將促凋亡作用發揮出來。Bax-Bax同源二聚體會在具有較低的Bcl-2/Bax比值的情況下形成，為細胞凋亡提供良好的前提條件。更為穩定的Bax-Bcl-2異源二聚體會在具有較高的Bcl-2/Bax比值的情況下形成，對細胞凋亡進行抑制，即癌細胞抗凋亡活性隨著Bcl-2/Bax比值的提升而提升，抗凋亡能力隨著膠質瘤病理分級的提升而提升。Bcl-2和Bax蛋白間競爭性二聚化作用引發了Bcl-2/Bax比值的變化。因此，在判定膠質瘤惡性程度的過程中，測定Bcl-2/Bax比值能夠將重要的參考依據提供給臨床。此外，Bcl-2還能夠對線粒體滲透性轉換孔的開啟進行調節，對細胞色素色C進行抑制，從而對Caspase-3活化進行抑制。Bcl-2也調節抑制著Caspase-3的合成。

Caspase-3歸屬于Caspase家族，在執行凋亡過程中發揮著極為重要的作用，其在細胞質中存在，通常情況下，其存在形式為非活化的酶原形式，被激活途徑為凋亡信號刺激，能夠降解多種蛋白底物，從而在細胞凋亡中將重要作用發揮出來。相關醫學研究表明[8-10]，Caspase-3能夠為細胞凋亡的發生提供良好的前提條件，途徑為對細胞周期進行阻滯，對細胞結構物質進行裂解，將其平衡狀態與修復機制破壞等。此外，Caspase-3還能夠對凋亡抑制蛋白Bcl-2進行降解，激活并水解Caspase家族成員，促進級聯反應的發生，最后在核小體連接處對DNA鏈接片段進行切割，為細胞凋亡的發生提供良好的前提條件。

相關醫學研究表明[11-12]，腦膠質瘤惡性進展和Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達具有極為密切的關系，膠質瘤病理級別隨著Ki-67、Bcl-2表達水平上調、Bax、Caspase-3表達水平下調而提升。同時，在膠質瘤的治療中，Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3可能成為有效靶點，將新的思路提供給臨床。本研究結果和上述相關醫學研究結果一致。但是，多種凋亡基因、抑癌基因等也可能對膠質瘤的發生發展造成直接而深刻的影響，因此需要相關醫學學者對膠質瘤的調控機制尚需要進一步研究。

總之，Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3在腦膠質瘤組織中的表達水平能夠將有效依據提供給臨床判斷患者膠質瘤惡性程度及評估患者預后的工作，值得推廣。