子癇前期患者中孕期子宮動脈血流多普勒聯合血清miR-10b檢測的臨床應用價值*

張 娟，郝璞珩，梁 超

1.陜西省寶雞市婦幼保健院產科(寶雞721000),2.西安醫學院第一附屬醫院(西安710077)，3.寶雞職業技術學院醫學院(寶雞721013)

主題詞 先兆子癇 子宮動脈 超聲檢查, 多普勒 微RNAs

子癇前期(Preeclapmpsia,PE)發病率約為3%～8%,作為妊娠期特有疾病，以高血壓、蛋白尿、水腫、多器官功能障礙為特征，引發多種嚴重的母兒并發癥，甚至危及生命，造成不良妊娠結局[1-2]。PE病因不明[3],目前臨床上尚缺乏有效的PE預測診斷方法。近年來，PE發病機制研究以及探尋預測疾病生物標記物領域都取得了一定的進展。有研究表明,相較于孕晚期,中孕期患者血清中微小RNA具更好的特異性,有成為PE疾病生物標志物的可能性[4]。miR-10b與PE疾病相關，其能夠靶向調控可溶性血管內皮生長因子受體-1(Soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)[5]，而血清sFlt-1作為PE預測標志物已得到了一定認可[6]。此外,在妊娠中晚期檢測子宮動脈血流頻譜參數對于預測妊娠高血壓疾病的發生風險具有良好的應用價值[7]。因此，本研究擬探討中孕期血清miR-10b檢測聯合子宮動脈血流多普勒應用在PE患者臨床預測診斷中的價值。

資料和方法

1 一般資料 選取2016年1月至2017年1月于寶雞市婦幼保健院行常規產檢的孕婦141例；平均年齡(27.3±2.4)歲，孕周28～32周。為排除混雜因素對最終觀察結果的影響,設定納入標準：①年齡<35歲；②分娩史≤2次；③身體質量指數(BMI)<28 kg/m2；④既往無高血壓或子癇病史，即時血壓測量<140/90 mmHg；⑤無孕早期藥物、放射線及毒物接觸史；⑥既往無遺傳性、傳染性疾及代謝性疾病病史及其他妊娠期合并癥。本研究經我院倫理委員同意并批準，所有患者均簽署知情同意書。

2 研究方法

2.1 標本采集：所有研究對象均于中孕孕期(28～32周)范圍內產檢時，獲取知情同意后，晨起采集空腹肘靜脈血5 ml。3000 r/min離心5 min后，吸取上層血清，標記后置于-80℃冰箱保存待測。

2.2 熒光實施定量PCR(RT-qPCR)：按RNAisoTMPlus試劑盒(TaKaRa公司)說明步驟，提取血清樣本總RNA；紫外分光光度儀定量并檢測總RNA特異性(A260/A280均在1.8～2.0之間)；甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA完整性后，待用。根據PrimerBank公布的基因序列，設計miR-10b及內參U6、的引物序列(見表1)；吸取1 μl/2μl(1 μg/μl)總RNA為模板，按試劑盒說明(TaKaRa公司)反轉錄合成miR-10b cDNA；根據實時定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)說明配制反應體系后加樣，以U6為內參，進行PCR反應，具體反應條件(見表1)。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，應用凝膠圖象成像系統(Alpha Innotech公司)檢測PCR產物質量。每個樣本設置2個復孔，每批樣本設置1孔空白對照。目的基因miR-10b的相對表達量采用公式2-△△Ct(△Ct=目的基因Ct值-內參照Ct 值，△△Ct=實驗組△Ct-對照組△Ct)進行計算。

表1 引物序列及PCR反應條件

2.3 子宮動脈血流多普勒超聲檢測：采用美國GE公司的VolusonE8型彩色多普勒超聲診斷儀，經腹檢查探頭頻率型號為C1-5-D，探頭頻率3.5 MHz。檢查前囑孕婦取仰臥位，充分暴露恥骨上至劍突下區域。主要觀察內容：在彩色多普勒血流成像(CDFI)模式下，使用探頭尋找雙側子宮動脈，確定觀察位置后，在取樣角度下仔細觀測，獲取≥5個清晰的典型多普勒頻譜，測量、記錄阻力指數(RI)、搏動指數(PI)以及收縮期峰值血流速度與舒張末期血流速度的比值 (S/D)。再進行胎兒及附屬物的超聲測量及檢查。

3 隨訪及分組方法 所有患者均隨訪至最終妊娠結局。按照謝幸、茍文麗主編第8版《婦產科學》作為診斷標準，依據孕晚期及終止妊娠后臨床診斷結果，分為正常孕產婦組(對照組)和PE孕產婦組(PE組)。

結 果

1 隨訪結果 依據最終的孕晚期及終止妊娠后臨床診斷結果，141例孕產婦中共有24例發生PE(17%)，117例正常孕產婦，所有孕婦妊娠結局良好，無嚴重母胎合并癥及非計劃再次手術發生。

2 兩組患者基本資料 記錄并對比分析兩組患者年齡、采血時孕周、孕次、體重指數、即時血壓(采血時測量血壓)、分娩孕周等變量資料，見表1。兩組分娩孕周比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組孕婦一般資料

3 PE組和對照組中孕期血清miR-10b表達水平比較 RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，PE組中孕期血清miR-10b水平明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組孕婦中孕血清miR-10b水平比較

4 PE組和對照組中孕期子宮動脈血流多普勒頻譜參數比較 子宮動脈血流多普勒超聲檢測結果提示，PE組中孕期子宮動脈血流多普勒頻譜參數阻力指數(RI)、搏動指數(PI)以及收縮期峰值血流速度與舒張末期血流速度的比值 (S/D)，均高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 中孕期子宮動脈血流多普勒頻譜參數比較

5 血清miR-10b表達水平聯合中孕期子宮動脈血流多普勒頻譜參數對PE的診斷預測價值 應用ROC曲線分析超聲指標RI、PI、S/D以及血清miR-10b檢測在單獨及聯合應用情況下對PE的診斷預測價值。結果顯示：單獨及聯合應用超聲指標RI、PI、S/D以及血清miR-10b表達檢測時的AUC面積均>80%，提示其診斷預測性比較好；聯合應用時AUC面積>單純超聲指標的診斷AUC面積，提示聯合應用診斷指標具有較好的臨床價值。此外，對于PE患者，超聲指標RI、PI、S/D聯合血清miR-10b表達檢測的診斷敏感性和特異性較高(圖1),見表4。

Model I : 單純超聲指標RI,PI,S/D診斷；Model II: 聯合超聲指標RI,PI,S/D聯合血清miR-10b表達檢測診斷

圖1 血清miR-10b表達水平聯合中孕期子宮動脈血流 多普勒頻譜參數預測PE的ROC曲線

注：Model I,單純超聲指標RI,PI,S/D診斷；Model II,聯合超聲指標RI,PI,S/D聯合血清miR-10b表達檢測診斷

討 論

作為常見的妊娠期疾病，PE在我國發生率較高，因其病因不明，且缺乏安全有效的早期診斷預測方法[8]，往往發病時孕婦機體已發生了不可逆轉的病理生理變化，故而其導致圍生期母嬰病死率較高[9]，臨床并發癥多[9-11]。

子宮動脈因其解剖學特點，下行至子宮下段-宮頸水平時，依靠超聲手段，可觀測到清晰的血流多普勒影像，隨著孕周的發展，子宮動脈血流阻力逐漸下降[12]。PE時，滋養細胞功能異常，子宮螺旋動脈重鑄障礙，胎盤淺著床，異常形成的子宮螺旋動脈血管阻力下降不明顯，甚至于不下降[13]。而多普勒超聲則能夠較好的檢測子宮動脈血管阻力變化。Sterling等[14]發現，合并妊娠高血壓疾病的孕婦，其孕中晚期子宮動脈PI、RI以及S/D均高于正常孕婦，提示子宮動脈血流多普勒檢測具有良好的疾病預測應用價值。本研究中發現，相較于正常孕產婦，PE組中孕期子宮動脈血流多普勒頻譜參數PI、RI以及S/D值明顯增高(P<0.05)；應用ROC曲線分析單獨應用超聲指標RI、PI、S/D對于PE預測診斷的敏感性和特異性均較高：分別為84.62%、86.01%；這與Sterling等的發現結果具有一致性，提示子宮動脈血流多普勒檢測對于PE的預測診斷具有一定臨床價值。

miRNA通過對其靶基因調控，影響多種人體生理過程，參與包括PE在內的諸多疾病過程。而血液循環中miRNA的特異性等特點使其具備了成為疾病早期診斷分子標記物的可能；目前已有報道指出[15]利用非胎盤生物樣本定量比較細胞中miRNA來評估及預測PE疾病。Li等人通過對比中孕期32例PE和正常孕婦血清中多種微小RNA的表達水平，發現中孕期血清微小RNA有成為PE疾病生物標志物的可能性[4]。本研究中發現與對照組(n=117)相比，PE組(n=24)中孕期血清miR-10b水平明顯降低(P<0.05)，進一步驗證了Li等人的發現。應用ROC曲線分析血清miR-10b表達檢測時的AUC面積均>80%,提示其的確具有較好的診斷預測性,進一步驗證了Li等人的發現。此外，與單純應用超聲指標進行PE預測診斷相比，超聲指標聯合血清miR-152表達檢測，具有較好的診斷敏感性(84.62%)和更佳的特異性(90.51%)。

sFlt-1作為胎盤生長因子 (Placental growth factor，PLGF)的特異性可溶性受體，它們之間的表達失衡，影響滋養細胞功能，并進一步引發螺旋動脈重鑄障礙，胎盤淺著床，繼而導致PE發生。sFlt-1參與PE發病及其作為疾病預測的有效指標已得到了一定驗證[15]。但有研究表明，sFlt-1單獨應用于PE預測時的靈敏度僅為73.1%[16]；而sFlt-1與miR-10b之間的負性調控關系已得到了驗證[10]。因此，在臨床實際工作中，應用血清miR-10b檢測，能夠一定程度提高疾病預測的特異性、準確性。

綜上所述，中孕期子宮動脈血流多普勒檢測具有可操作性、簡便性等特點，而血清miR-10b檢測，則具有較好的臨床特異性；兩者相互彌補，聯合應用，在子癇前期的疾病監測、預測診斷中具有一定的臨床價值。