等位基因多重PCR技術快速診斷耐藥結核病的應用研究*

甘昭平，梁亞萍,趙 濤,王 卓，李 靜，鄒遠嫵

陜西省結核病防治院(西安 710100)

主題詞 結核分枝桿菌 結核, 抗多種藥物性 廣泛耐藥結核 @MAS-PCR

耐多藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)的流行和出現是我國結核病控制面臨的主要威脅。根據國家基線調查的最新數據，估計每年有120 000個新的耐多藥結核病病例和10 000個新的廣泛耐多藥結核病病例[1]。耐藥結核病的流行持續威脅著結核病控制工作已取得的進展，廣泛耐藥結核病的出現更加劇了這一威脅， 因此，MDR-TB、XDR-TB診斷尤為重要。近年來，隨著分子生物學的發展，分子生物學在結核病的診斷中應用越來越廣泛，國內外研究人員已開始利用等位基因特異性多重PCR即MAS-PCR技術對結核分枝桿菌進行抗結核藥物異煙肼、利福平、氧氟沙星、卡那霉素和卷曲霉素的耐藥相關基因突變位點進行檢測[2-5]，建立了MAS-PCR技術[5]，用來快速診斷MDR-TB、XDR-TB。本研究利用MAS-PCR技術對108株含MDR-TB、XDR-TB和敏感菌株的結核分枝桿菌臨床分離株進行分子耐藥檢測，并與改良羅氏比例法藥敏試驗結果進行比較，評價MAS-PCR技術的臨床實用價值。

對象與方法

1 研究對象 本研究收集本院2015年8月至2016年8月結核病患者結核分枝桿菌液體快速培養陽性的結核患者108例，其中男72例，女36例，年齡20～78歲，平均年齡(38.5±6.3)歲。對這些患者的108例結核分枝桿菌臨床分離株(含MDR-TB，XDR-TB和敏感菌株)，使用MAS-PCR技術進行異煙肼、利福平、氧氟沙星、卡那霉素和卷曲霉素藥物敏感試驗,并和羅氏固體比例法藥敏試驗(金標準)進行符合率的比較。

2 方 法

2．1 羅氏比例法藥敏試驗：采用貝索公司生產的改良羅氏固體藥敏培養基行異煙肼、利福平耐藥 氧氟沙星，卡那霉素和卷曲霉素藥敏實驗，試驗過程嚴格按照標準操作規程進行操作[6]。

2.2 MAS-PCR技術方法[7]：采用的外引物序列為：gyraF 5’-TATGCGATGAGCGTGAT-3’；gyraR 5’-GATATTGGTTGCCATGCC-3’,內引物序列為：gyraF1 5’-ACCACCCGCACGGCGATGC-3’；gyraR1 5’-GCCATGCGCACCAGGTTGT-3’，對于內引物序列，在3’端引入了錯配堿基(下劃線標注)，有效地阻止了錯誤延伸[8]；反應條件采用降落PCR：95℃預變性5min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，5個循環；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，5個循環；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 40s，20個循環，最后72℃延伸3 min。挑選少量有代表性的耐藥突變及野生型的菌株為模板，優化反應條件，利用5個不同的反應體系分別檢測出結核分支桿菌對五種不同藥物的耐藥性。試驗用的引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

3 質量控制 每批藥敏試驗均采用結核分枝桿菌標準株H37Rv做質量控制，H37Rv標準株由陜西省結核病防治所結核病實驗室提供，標準株對這五種抗結核藥均敏感。

結 果

用MAS-PCR檢測108株含MDR-TB，XDR-TB和敏感菌株的臨床分離株的藥物敏感試驗，同時采用改良羅氏固體比例法對這些菌株進行藥敏試驗，以比例法為金標準進行比較，異煙肼耐藥的敏感性、特異性、準確性、陽性預測值、陰性預測值分別為75.0%(36/48)、100%(57/57)、86.1%(93/108)、100.0%(36/36)、82.6%(57/69)；利福平耐藥的敏感性、特異性、準確性、陽性預測值、陰性預測值分別為76.4%(42/55)、100%(53/53)、88.0%(95/108)、100.0%(42/42)、80.3%(53/66)；卡那霉素耐藥的敏感性、特異性、準確性、陽性預測值、陰性預測值分別為100.0%(11/12)、100.0%(96/96)、99.0%(107/108)、100.0%(11/11)、99.0%(96/97)；氧氟沙星耐藥的敏感性、特異性、準確性、陽性預測值、陰性預測值分別為75.0%(15/20)、98.9%(87/88)、94.4%(102/108)、93.8%(15/16)、94.6%(87/62)；卷曲霉素耐藥的敏感性、特異性、準確性、陽性預測值、陰性預測值分別為77.8%(7/9)、99.0%(98/99)、97.2%(105/108)、87.5%(7/8)、98.0%(98/100)。見表1、表2。

表1 MAS-PCR技術與羅氏比例法藥敏方法的比較(例)

表2 MAS-PCR技術藥敏方法評價

討 論

2018年3月24日“世界結核病防治日”的活動主題是“開展終結結核行動，共建共享健康中國”，旨在倡導社會各界力量積極行動起來，采取有效措施，為控制結核病疫情、消除結核病的社會危害，實現健康中國而共同奮斗。而耐藥結核病，尤其是MDR-TB和XDR-TB的出現和蔓延，已嚴重阻礙了這項工作的進程。

由于耐藥結核病的診斷復雜，治療困難，往往療程很長，耐多藥病人一般需要18～24個月，而且醫藥費用是治療一般病人的100倍左右，因此耐藥結核病的治療對個人、家庭及社會均造成巨大的經濟壓力。

大部分MDR-TB和XDR-TB結核病是可以預防的，預防的關鍵是早期發現病人，并給予規范化治療，使病人徹底失去傳染性。另外，為減少和預防耐藥結核菌的傳播，建議耐藥結核患者尤其是耐多藥結核患者早期應住院治療。但是，對于這些患者再采用標準化療方案治療會產生更大的風險，應根據異煙肼、利福平、喹諾酮，卷曲霉素，卡那霉素等主要抗結核藥的藥物敏感試驗結果，進行相應的藥物調整，個體化精準治療，以確保方案中有4種有效或幾乎有效的核心藥物，這對于控制耐藥結核病極為關鍵。因此快速、敏感、準確的藥敏檢測不僅是臨床選擇和評價化療方案的有效依據，還是重要的流行病學指標，以確保及時和充分地調整耐多藥結核病的治療，盡量減少耐多藥結核病的傳播，并防止廣泛耐藥結核病的發展。

但長期以來，我國的結核病實驗室通常采用以固體培養基的絕對濃度法或比例法進行藥敏檢測，這些方法盡管具有簡單、經濟等優勢，但等待的時間比較長需要4周，液體培養的快速藥敏檢測方法如BACTEC MGIT 960，也需要一周左右才能出結果[9]，還只能做一線抗結核藥的藥敏試驗，而且培養陽性的患者才能做藥敏，而培養的陽性率比較低，遠不能滿足快速發現耐藥結核病及臨床診治的需要。近年來，由于分子生物學技術的發展，結核桿菌的耐藥機制及其分子基礎已基本明了，也相應建立了一些檢測結核分枝桿菌耐藥相關基因的分子生物學方法，為快速檢測耐藥結核病和廣泛耐藥結核病開辟了一條新的途徑。本研究的MAS-PCR技術能夠檢特異性地檢測基因的點突變，其原理為在同一個PCR體系中設計兩條外引物和一條內引物，內引物的3’端正好對應待檢測的突變位點。對于野生型敏感菌株，三條引物均可以起作用，即合成2條PCR產物；而當該位點發生突變時，內引物的擴增的效率就會顯著減低，因此只能觀察到外引物合成的1條PCR產物。近年來MAS-PCR技術開始用于細菌的耐藥檢測，該方法能夠快速鑒定結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌[10]，還能夠檢測異煙肼、利福平、氧氟沙星、卡那霉素和卷曲霉素這5種抗結核藥物的藥敏實驗，不僅具有較高的敏感性，特異性，準確性，陽性預測值，陰性預測值，收益較好，還快速、經濟、幾小時內就可以得到結果，而且僅需要PCR擴增儀、電泳儀等簡單的儀器[11]，操作也較為簡單，符合臨床實驗室快速實現對MDR-TB與XDR-TB的檢測需求。

作為一種檢測方法，MAS - PCR技術檢測方法它也有局限性：只能在培養陽性的菌株上評價，而不能直接在痰標本上評價；耐藥菌株數量較少，相對分析較少。在以后的研究中應加大耐藥菌株數量，最好能夠直接在痰標本進行藥敏評價。這樣就為MDR-TB與XDR-TB的診斷、監測及有效控制提供新技術手段，控制耐藥結核病的蔓延，對終結結核病的目標具有促進作用和意義。