氮添加對杉木林土壤有機碳礦化速率及酶動力學參數溫度敏感性的影響

董清馨,張心昱,*,王輝民,付曉莉,郭志明,陳伏生

1 中國科學院地理科學與資源研究所生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室,北京 100101 2 中國科學院大學資源與環境學院,北京 100190 3 江西農業大學江西省竹子種質資源與利用重點實驗室,南昌 330045

由于世界范圍內化石燃料燃燒、工業發展以及人造氮肥的生產和使用,全球氮循環大規模加速,氮沉降顯著增加[1]。在我國南方熱帶、亞熱帶森林中,大氣氮沉降量已經達到了30—73 kg N hm-2a-1[2]。生態系統的大氣氮沉降增加可以加速土壤有機碳礦化、增加養分有效性、促進植物對養分的吸收,但系統中的氮一旦超過植物及土壤微生物對氮的蓄積能力,生態系統將出現氮飽和的情況,導致土壤硝酸鹽淋溶、土壤的酸化等問題[3]。

土壤碳庫是生態系統中最大并且最活躍的有機碳庫[4],土壤有機碳礦化是土壤有機碳在微生物作用下被分解變為簡單無機化合物并釋放二氧化碳(CO2)的過程[5],其強弱可用其礦化速率表示(Cmin),可指示土壤有效養分含量的高低。土壤Cmin的溫度敏感性(Q10)是指土壤溫度每升高10℃,土壤有機碳礦化速率增加的倍數,Q10數值越大表示溫度敏感性越高[6]。IPCC報告指出,1880年以來陸地和海洋表面溫度平均每年增加0.85℃,預計到2100年全球溫度將增加4—7℃[7]。在未來全球氣候變暖的背景下,溫度升高可能會促進碳礦化速率的增加,因此準確理解土壤碳礦化對增溫的響應具有重要意義[8]。過量的氮輸入極大地影響了陸地生態系統的碳循環過程[9]。目前關于氮添加對土壤有機碳礦化速率溫度敏感性研究較多,但結果有促進[10-11],抑制[2, 12-13]。有機碳礦化速率及溫度敏感性受底物質量[14]、微生物群落組成和養分有效性[15]等多種因素的影響,相關研究結果尚無統一定論。

土壤有機碳礦化過程是由土壤微生物驅動,土壤酶介導完成的[16]。土壤微生物是參與土壤有機碳礦化和養分循環的關鍵要素[17]。土壤中β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)催化纖維素和半纖維素的分解為葡萄糖。水解酶促反應遵循米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S]),其中,Vmax是酶促反應的最大潛在反應速率,表示底物濃度充足時,土壤酶的最大潛在活性；Km是半飽和常數,即1/2Vmax時的底物濃度,表示酶與底物結合的親和性的強弱[18]；Vmax/Km是催化效率[19]。關于酶動力學參數及其溫度敏感性的研究,是近年來土壤酶學領域的熱點問題[19-22]。目前,氮添加如何影響水解酶動力學參數溫度敏感性還不清楚。

我國杉木(Cunninghamialanceolata)林種植面積已達911萬hm2,分別占中國和世界的18%和5%[23]。本研究分析氮添加對杉木林土壤有機碳礦化及βG動力學參數溫度敏感性的影響,為氮沉降背景下土壤碳素循環的生物化學過程對增溫響應的模型提供重要參數。

1 材料和方法

1.1 樣地概況

研究樣地位于江西省泰和縣石溪林場(26o52′44″N,115o13′04″E,海拔102 m),該站點屬典型的中亞熱帶季風氣候[24],年平均氣溫和降水量分別為17.9℃和1471.2 mm[25]。樣地杉木(Cunninghamialanceolata)建于2000年[26]。土壤類型為典型低鹽基濕潤弱育土,土壤母質為紅色砂巖和泥石風化物[27]。樣地未施氮前的土壤容重為1.31 g/cm,pH為4.6,土壤有機碳(SOC)含量為17.68 g/kg,全氮(TN)含量為1.12 g/kg,全磷(TP)含量為0.1 g/kg[28]。

1.2 試驗設計

1.2.1 長期氮添加控制試驗

在2011年11月設置杉木林樣方,選擇9個400 m2(20 m × 20 m)的樣方,并且每個樣方間有10 m的緩沖地帶。按氮添加量的高低設置3個處理：對照(N0),低氮(N1：50 kg N hm-2a-1),高氮(N2：100 kg N hm-2a-1),每種處理3次重復,施用氮肥為NH4NO3。自2012年開始施肥,每年4次,其中生長季(6月、9月)施肥量為全年的30%,非生長季(3月、12月)施肥量為全年的20%。本研究在2017年9月采用5點混合法采樣。除去地表凋落物層后,用直徑2 cm的土鉆采集0—10 cm土壤樣品,過2 mm篩,剔除根系殘體,自封袋密封后用冷藏箱運回實驗室,4℃冰箱保存。

1.2.2 室內控溫培養實驗

對杉木林3個處理、3個重復共9個樣品進行室內溫度梯度培養,分別設置10℃、15℃、20℃、25 ℃、30 ℃、35℃、40℃共7個培養溫度,總計63個樣品。

具體步驟為：稱取相當于40 g干土重的鮮土,裝入100 mL圓口塑料瓶中,土壤樣品含水量調節至60%的田間持水量[29],放入恒溫(20℃)、恒濕(80%)培養箱內預培養4 d,然后放入上述溫度梯度的培養箱,在恒濕條件下培養7 d。在培養過程中,采用稱重法給土壤樣品補水,每隔2—3 d補水1次。

1.3 樣品分析

1.3.1 土壤理化性質

1.3.2 土壤碳礦化速率及溫度敏感性

在室內控溫培養的第1、3、5、7 d,采用實驗室自主研發的室內土壤微生物呼吸自動連續測定裝置[31],測定Cmin,計算4次Cmin平均值,Cmin的計算公式為：

Cmin=C×V×α×β/m

式中,Cmin為土壤有機碳礦化速率(μg C d-1g-1)；C為在測試時間內CO2濃度變化的直線斜率；V為管線和培養瓶的總體積(ml)；α為CO2氣體體積轉化為質量的系數；β為時間(s) 轉化為天數(d)的系數；m為培養瓶內干土質量(g)。

土壤有機碳礦化速率溫度敏感性的計算公式為：

Cmin=a×ebT

Q10(Cmin)=e10b

式中,T為自記式紐扣溫度計記錄的土壤溫度(℃)；a表示0℃時土壤有機碳礦化速率(μg C d-1g-1)；b為溫度反應系數,a和b由土壤有機碳礦化速率與溫度擬合獲得；Q10(Cmin)為土壤有機碳礦化的溫度敏感性,即溫度每升高10℃土壤有機碳礦化速率增加的倍數[32]。

1.3.3 土壤β-1,4-葡萄糖苷酶動力學參數及溫度敏感性

分別取培養后63個土壤樣品的1 g鮮土于燒杯中,加入125 ml pH=4.5—5的醋酸緩沖液(50 mmol/L),用玻璃棒攪拌,及旋渦振蕩器混勻,制成土壤懸浮液；吸取土壤懸浮液200 μL于96孔微孔板,再加入50 μL的4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUB-β-D-glucopyranoside)作底物,底物濃度梯度設置為5、10、20、30、40、60、100和200 μmol/L,在標準物質孔中加入50 μL濃度為10 μmol/L的標準物質4-甲基傘形酮(4-MUB,4-methylumbelliferyl)和200 μL的醋酸緩沖液,樣品分析設置8個重復,同時設置空白。所有微孔板在相應溫度培養箱黑暗條件下培養4 h。

停止培養后,每個孔加入10 μL 1mol/L NaOH溶液,過1 min后,采用微孔板熒光法在360 nm激發、460 nm下進行測定(SynergyH4, BioTek)[33-34]。

在SigmaPlot 10.0軟件中對酶活性和底物濃度進行米氏方程雙曲線擬合,計算土壤酶動力學參數(Vmax和Km),計算公式為：

V=Vmax[S]/(Km+[S])

式中,V為酶促反應速率(nmol g-1h-1)；S為底物濃度(μmol/L)；Vmax為酶促反應的潛在最大速率(nmol g-1h-1)；Km為半飽和常數(μmol/L)。

土壤酶動力學參數溫度敏感性的計算公式為：

Q10=eSlope×10

式中,Slope為對Vmax和Km進行對數轉換,與培養溫度建立線性回歸方程的斜率[15]。

1.4 數據統計分析

利用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。采用協方差分析(ANCOVA)對不同氮添加水平和培養溫度下的Cmin和βG動力學參數進行顯著性檢驗,氮添加處理作為主影響因子,培養溫度作為協變量。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對不同處理土壤理化性質、土壤Cmin以及βG動力學參數的溫度敏感性進行顯著性檢驗,采用Duncan法進行多重比較(P=0.05)。2017年9月采樣時樣地土壤溫度為27 ℃,因此選擇相近的30℃培養下的土壤Cmin、βG動力學參數,30—40℃培養溫度下βG動力學參數的Q10值和土壤環境因子,采用Pearson法進行相關分析。利用SigmaPlot 10.0軟件作圖。圖表中數據為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 氮添加對土壤理化性質的影響

2.2 氮添加對有機碳礦化速率及溫度敏感性的影響

在10—40℃培養溫度范圍內,不同氮添加處理的土壤Cmin隨溫度的增加而呈指數增加,為N2>N1>N0。協方差分析結果表明,氮添加對Cmin的影響極顯著(P<0.05)。N0、N1、N2的Q10(Cmin)大小分別為1.21、1.20、1.14,但處理間均無顯著差異(圖1)。

表1 氮添加對土壤理化性質的影響

每列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05,n=3),數據表示平均值±標準誤；N0(對照),N1(50 kg N hm-2a-1),N2(100 kg N hm-2a-1)；SOC：Soil Organic Carbon；TN：Total Nitrogen；TP：Total Phosphorus；DOC：Dissolved Organic Carbon；aP：available Phosphorus；C/N：Carbon/Nitrogen；DOC/SOC：Dissolved Organic Carbon/Soil Organic Carbon

圖1 不同氮添加水平土壤有機碳礦化速率及溫度敏感性Fig.1 Soil organic carbon mineralization rate and their temperature sensitivity under different nitrogen additionsCmin：土壤有機碳礦化速率,soil organic carbon mineralization rates

2.3 氮添加對β-1,4-葡萄糖苷酶動力學參數及溫度敏感性的影響

圖2 不同氮添加水平β-1,4-葡萄糖苷酶動力學參數及溫度敏感性Fig.2 Kinetic parameters and their temperature sensitivity of β-1,4-glucosidase under different nitrogen additionsVmax：最大反應速率,maximum rates of velocity ；Km：半飽和常數,half-saturation constant ；Vmax/Km:催化效率,catalytic efficiency

不同氮添加水平下的lnVmax、ln(Vmax/Km)與溫度呈顯著正相關,且值大小為N2>N1>N0(P<0.05)。不同氮添加水平的Q10(Vmax)和Q10(Km)的大小都表現N2>N1>N0,并且差異顯著,而不同處理間Q10(Vmax/Km)無顯著差異(圖2)。

2.4 相關分析

表230℃土壤有機碳礦化速率、β-1,4-葡萄糖苷酶動力學參數和土壤環境因子的相關性

Table2Thecorrelationsbetweensoilorganiccarbonmineralizationrate,kineticparametersofβ-1,4-glucosidaseandthesoilenvironmentalfactorsat30℃

參數ParameterspH有機碳SOC全氮TN全磷TP可溶性碳DOC銨態氮NH+4-N硝態氮NO-3-N有效磷aPCminCmin-0.4310.4380.1040.841??0.195-0.1940.890??0.729?1.000Vmax-0.720?-0.040-0.2570.894??0.404-0.5340.822??0.2750.739?Km-0.010-0.441-0.794?0.0800.195-0.1980.326-0.0960.177Vmax/Km-0.675?0.2850.2770.803??0.224-0.3830.5420.3440.589Q30—40℃10(Vmax)-0.704?-0.596-0.2360.2580.188-0.4220.485-0.4440.129Q30—40℃10(Km)-0.390-0.0280.4300.1090.033-0.1680.115-0.184-0.015Q30—40℃10(Vmax/Km)-0.073-0.440-0.800??0.0780.115-0.1510.273-0.1080.145

3 討論

3.1 氮添加對土壤理化性質的影響

3.2 氮添加對土壤有機碳礦化速率及溫度敏感性的影響

氮添加量越高,土壤Cmin越高,這與Wang[13]、向元彬[41]等研究結果一致。氮添加增加了土壤有效氮、磷養分含量,促進微生物生物量增加[28],并促進微生物分泌獲取能量的酶活性,增加土壤有機碳礦化速率[41]。有機碳礦化速率除與土壤養分含量有關,還受底物中元素比值的影響[42],較低的C/N表示微生物的有機碳分解作用更強,反之則較弱[43]。但本研究中氮添加對土壤C/N無顯著影響表明本研究中C/N不是影響Cmin的主要因子。

土壤有機碳礦化速率的Q10值隨氮添加量的升高而下降,但處理間差異不顯著。Mo[2]在我國南方亞熱帶森林的研究也顯示有機碳礦化速率的Q10值隨氮添加量的升高而顯著下降。Mo認為溫度是影響Cmin最主要因素,但大量氮添加改變了溫度對土壤呼吸速率的控制作用[2]。與之相比,本研究樣地氮添加為7a,而Mo樣地氮添加為15a,相對較短時間的氮添加處理可能是導致差異不顯著的原因。Q10(Cmin)受多種因素影響,如有機質穩定性、底物有效性和微生物活性等[44]。根據酶動力學原理,分子結構越復雜的底物,即生物化學上越難分解的有機質,其分解所需要的活化能就越高,其Q10值就越高[14]。本研究不同氮添加處理下土壤DOC/SOC無顯著差異,這也可能是造成不同氮添加處理下的Q10(Cmin)也無顯著差異的原因之一。

3.3 氮添加對土壤β-1,4-葡萄糖苷酶活性動力學參數及溫度敏感性的影響

不同氮添加水平βG的Vmax和Vmax/Km隨溫度升高而增大,這是因為溫度升高,酶分子活動加劇,βG和底物反應速率增大,導致Vmax和Vmax/Km增加[21]。本研究中氮添加導致土壤氮磷含量增加,從而導致微生物能量(碳素)相對缺乏,根據微生物分泌酶的經濟性原則[45-47],微生物產生更多與碳分解有關的酶(如βG),分解土壤中的纖維素、半纖維素等,提高土壤有機碳分解速率的同時也增大碳水解酶βG的活性以及酶和底物的催化效率[26],在溫帶森林研究結果與本研究的結果一致[15]。土壤酶Vmax和Cmin正相關表明,未來氮沉降繼續增加情景下,氮添加滿足微生物的養分和能量需求,微生物將分泌更多βG水解酶,進一步促進有機碳分解。

不同氮添加處理條件下,βG的Km隨溫度增加出現了增加、降低、不相關3種趨勢。目前對于Km隨增溫的變化趨勢的研究結果不一致[15, 20],說明溫度不是影響酶與底物親和性的唯一因素。N0的lnKm隨溫度線性降低,這是因為溫度越高,酶與底物活動劇烈,結合更緊密,親和性更高[42]。而N2 的lnKm隨溫度線性升高,表明土壤中可能存在吸附于土壤顆粒上的其他可與酶反應的物質,其溫度升高會促進這些物質的解吸附作用,與底物競爭結合酶的活性中心,導致Km增加[15]。

氮添加同時增加了Vmax和Km的Q10值,導致對Q10(Vmax/Km)值無影響。亞熱帶地區溫度較高,氮添加增加βG的動力學參數的Q10值,表明微生物可以適應當地氮沉降增加和增溫條件。溫帶森林氮添加對酶動力學參數溫度敏感性的研究顯示,氮添加對所測5種酶的Q10(Vmax)無明顯影響,但顯著增加了木糖苷酶(βX)的Q10(Km)[15]。酶動力學參數的溫度敏感性與土壤環境、底物有效性等多種因素有關[18]。本研究施氮量(50、100 kg N hm-2a-1)高于溫帶森林施氮量(25.2、35 kg N hm-2a-1)[15],這可能導致本試驗水解酶活性對溫度更為敏感。而通過分析30—40℃范圍內βG的Q10(Vmax)和Q10(Vmax/Km),發現前者與pH負相關,后者與TN正相關,說明土壤環境是影響動力學參數溫度敏感性的重要因素。

4 結論

氮添加增加土壤有機碳礦化速率、β-1,4-葡萄糖苷酶的最大潛在反應速率和催化效率,并且高氮處理效果更顯著。氮添加對β-1,4-葡萄糖苷酶最大潛在反應速率和半飽和常數的溫度敏感性有顯著促進作用,且高氮處理效果更顯著,但氮添加對有機碳礦化速率和β-1,4-葡萄糖苷酶催化效率的溫度敏感性影響不顯著。30℃培養溫度下的數據相關分析表明,土壤有機碳礦化速率與土壤全磷、硝態氮、有效磷、β-1,4-葡萄糖苷酶最大潛在反應速率正相關；β-1,4-葡萄糖苷酶最大潛在反應速率與土壤總磷、硝態氮含量正相關,與土壤pH負相關；半飽和常數和全氮負相關；催化效率和pH負相關,和全磷正相關。30—40℃培養溫度下,β-1,4-葡萄糖苷酶最大潛在反應速率的溫度敏感性和pH負相關,催化效率的溫度敏感性和全氮負相關。本研究結果表明,未來氮沉降加劇和全球變暖情景下,亞熱帶杉木林土壤β-1,4-葡萄糖苷酶活性和催化效率會持續增強,土壤有機碳礦化速率會增加。