產愈創木酚類細菌的培養條件優化

周金虎，葉 凱，李 良，董孝元，李 夢，方尚玲，陳茂彬*

（1.發酵工程教育部重點實驗室（湖北工業大學），湖北 武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068；3.工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068；4.黃鶴樓酒業（咸寧）有限公司，湖北 咸寧 437000；5.武漢雅仕博科技有限公司，湖北 武漢 430068）

愈創木酚類物質是一類廣泛存在于醬香、濃香、兼香和芝麻香型白酒中的天然呈香化合物，對白酒香氣具有重要的貢獻[1]。研究表明，愈創木酚類物質是自由基清除劑，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧和預防心血管等多種疾病的發生，具有預防疾病、抗衰老、促進人體健康的作用[2-3]。

國內外的相關研究表明，產愈創木酚類物質的的菌主要是一些芽孢桿菌和圓酵母。王霜等[4]從兼香型白酒酒醅中篩選到2株高產4-乙烯基愈創木酚的菌株，地衣芽孢桿菌LS9和枯草芽孢桿菌S10。王少磊等[1]從濃香型大曲中篩選到一株高產4-乙基愈創木酚的菌株EG06，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

本試驗以從某濃香型酒廠窖泥中篩選到的高產愈創木酚的戴爾福特菌（Delftia sp.）為基礎，對細菌產愈創木酚類物質的培養條件進行了優化，以期為生產實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高產愈創木酚類物質的細菌為戴爾福特菌（Delftia sp.）：本實驗室從某酒廠窖泥中篩選。

種子培養基（營養肉湯培養基）[5]：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L，加10%NaOH溶液調整pH為7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

麩曲培養基[6]：麩皮100 g、水80 mL，水中加少量NaOH調整pH為7.2～7.4，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

5977B-7890B氣相色譜質譜聯用儀（gaschromatographymass spectrometer，GC-MS）：美國安捷倫公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；LRH-250生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

無菌條件下，挑取一環戴爾福特菌（Delftia sp.）接種于種子培養基中，37℃、180 r/min培養24 h。

1.3.2 單因素試驗設計[7-9]

麩曲培養基水分的確定：麩皮100 g，分別按50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL添加水，NaOH調整pH值為7.2～7.4，裝入500 mL三角瓶中，接入10%種子液，37℃培養48h。培養好的麩曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麩曲，加入飽和NaCl溶液1 mL，測定愈創木酚類物質含量。

培養時間的確定：麩曲培養基中接入10%種子液，于37 ℃分別培養24 h、30 h、36 h、48 h、60 h。培養好的麩曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麩曲，加入飽和NaCl溶液1mL，測定愈創木酚類物質含量。

接種量的確定：麩曲培養基中分別接入5%、7%、9%、11%、13%的種子液，37℃培養48 h。培養好的麩曲于35℃烘干48 h后粉碎，取0.5 g麩曲，加入飽和NaCl溶液1 mL，測定愈創木酚類物質含量。

培養溫度的確定：麩曲培養基中接入10%種子液，分別在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃培養48 h。培養好的麩曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麩曲，加入飽和NaCl溶液1mL，測定愈創木酚類物質含量。

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以麩曲培養基水分（A）、培養時間（B）、接種量（C）、培養溫度（D）為考察因子，以愈創木酚類物質含量（Y）為響應值，利用Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken Design進行響應面試驗設計，因素與水平編碼值見表1。

表1 細菌培養條件優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for bacteria culture conditions optimization

1.3.4 測定方法

愈創木酚類物質含量采用GC-MS法進行測定，采用外標法進行定量檢測[13]。

樣品處理：取樣品0.5 g，加入飽和NaCl溶液1 mL，頂空固相微萃取20 min。氣相色譜條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。進樣口溫度260℃，載氣為氦氣（He），流速1.0mL/min，不分流進樣。升溫程序為50℃，保持0min，再以20℃/min的速度升溫至150℃，保持0min，再以10℃/min的速率升溫至220℃，保持5 min。溶劑延遲：5 min[13]。

質譜條件：電子電離源（electron ionization，EI），采集類型：選擇離子監測（selected ion monitor，SIM）模式掃描。電子能量70 eV，離子源溫度230℃，MS四級桿溫度150℃，質量掃描范圍50.00～600.00 m/z。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 麩曲培養基水分對愈創木酚類物質含量的影響

圖1 麩曲培養基水分對愈創木酚類物質含量的影響Fig.1 Effect of moisture of bran medium on guaiacols content

由圖1可知，隨著麩曲培養基中水分的增加，愈創木酚類物質含量呈現出先增加后降低的趨勢，水分為80%時愈創木酚類物質含量最高，為3.476×10-4g/g；水分過低將降低營養物質傳輸、微生物生長、酶穩定性和基質膨脹，水分過高將導致顆粒結塊、通氣不暢和染菌，從而導致愈創木酚類物質含量下降，因此選擇麩曲培養基的水分為80%。

2.1.2 培養時間對愈創木酚類物質含量的影響

圖2 培養時間對愈創木酚類物質含量的影響Fig.2 Effect of culture time on guaiacols content

由圖2可知，隨著培養時間的延長，愈創木酚類物質的含量呈現先增加后降低的趨勢，培養時間為48 h時愈創木酚類物質含量最高，為3.521×10-4g/g。微生物的生長具有最適的生長周期，培養時間過短，微生物的對數生長期不能達到，菌的總體數量不多，沒有到達產酶的最佳時期，如果培養時間過長，菌種過度生長而衰老，同時在生長后期會產生一些有害代謝產物，不利于菌種的生長和代謝[10]。因此選擇培養時間為48 h。

2.1.3 接種量對愈創木酚類物質含量的影響

圖3 接種量對愈創木酚類物質含量的影響Fig.3 Effect of inoculum on guaiacols content

由圖3可知，隨著接種量的增加，愈創木酚類物質含量呈現先增加后降低的趨勢，當接種量為9%時愈創木酚類物質含量最高，為3.586×10-4g/g。分析原因可能是，適宜的接種量可以使菌株延滯期縮短，提前進入對數生活期，快速產酶提高愈創木酚類物質產量，當接種量＞9%時，愈創木酚類物質含量下降，原因可能是由于代謝產物的帶入，對菌株的生長起到抑制作用[11]。因此選擇接種量為9%。

2.1.4 培養溫度對愈創木酚類物質含量的影響

圖4 培養溫度對愈創木酚類物質含量的影響Fig.4 Effect of culture temperature on guaiacols content

由圖4可知，隨著培養溫度的升高，愈創木酚類物質含量呈現先增加后降低的趨勢，當培養溫度為37℃時愈創木酚類物質含量最高，為3.589×10-4g/g。分析原因可能是培養溫度過低，菌種生長的相對緩慢，到達對數生長期的時間會往后延長，因此產酶和愈創木酚類物質的含量會相對較低，而培養溫度過高，菌株生長較快，快速到達對數生長期，產酶和愈創木酚類物質含量較多，同時也會逐漸產生有害代謝產物，對菌株的生長起到抑制作用[12]。因此選擇培養溫度為37℃。

2.2 Box-Behnken試驗

2.2.1 Box-Behnken試驗設計與結果

由單因素試驗結果可知，不同試驗因素對愈創木酚類物質含量的影響有所不同。為了優化細菌麩曲中愈創木酚類物質含量的最佳條件，以中心組合試驗設計原理為依據，根據單因素試驗結果分析，進行4因素3水平響應面設計分析，共設計29次試驗，24次為析因試驗，5次中心試驗，響應面試驗設計及結果見表2，回歸模型方差分析結果見表3。

表2 細菌培養條件優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for bacterium culture conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert8.0.6軟件對表3的數據進行多元回歸擬合分析，得出響應面回歸方程如下：Y=3.65+0.16A+0.18B+0.20C+0.42D+0.18AB-0.27AC+0.68AD-9.750E-003BC+0.047BD+0.18CD-0.62A2-0.41B2-0.065C2-0.64D2。

由表3可知，根據F值各個因素對試驗結果影響次序為D＞C＞B＞A，即培養溫度＞接種量＞培養時間＞水分。建立的模型P＜0.0001，模型極顯著。失擬項P=0.5041＞0.05，表示純誤差不顯著。其中一次項B、C、D，交互項AD，二次項A2、B2、D2均呈極顯著（P＜0.01），交互項AC顯著（P＜0.05），說明相關因素對細菌麩曲中愈創木酚類物質的含量影響較大。決定系數R2=0.953 5，表明細菌麩曲中愈創木酚類物質含量實際值與預測值擬合度。校正決定相關系數R2Adj=0.907 0，表明該該模型中各因素對愈創木酚類物質含量變化情況。綜上所述，此模型有效，可以來預測分析各因素對愈創木酚類物質含量的影響。

2.2.2 響應面分析與優化

根據回歸方程繪制響應面分析圖，以確定水分、培養時間、接種量、培養溫度對愈創木酚類物質含量的影響，響應曲面和等高線見圖5。

圖5 水分、培養時間、接種量與培養溫度交互作用對愈創木酚類物質含量影響的響應面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between moisture,fermentation time,inoculum and fermentation temperature on guaiacol contents

由圖5可知，水分含量與培養時間交互作用、水分含量與接種量交互作用、水分含量與培養溫度交互作用、培養時間與接種量交互作用、培養時間與培養溫度交互作用、培養溫度與接種量交互作用的顯著性情況與表3中交互項P值的分析結果一致。響應面的坡度較為陡峭，表明愈創木酚類的產量對水分與培養時間、水分與接種量、水分與培養溫度、培養時間與接種量、培養時間與培養溫度、培養溫度與接種量的變化較為敏感[14]。在水分不變的條件下，隨著培養時間的延長，愈創木酚類物質含量呈先上升后下降的變化趨勢；在培養時間不變的條件下，隨著水分的逐漸增加，愈創木酚類物質含量呈先上升后下降的趨勢，且變化較大，其他交互因素同上[15]。

等高線呈圓形，表明2個因素之間的交互作用強度較弱，影響不顯著。等高線呈橢圓形，表明2個因素之間的交互作用強度較強，影響顯著。

通過Design Expert（v8.0.6）軟件分析，產愈創木酚的最佳條件為麩曲培養基水分81.56%、培養時間49.848 h、接種量11.0%、培養溫度38.288℃，此條件下愈創木酚類物質含量的理論值為3.986×10-4g/g。

2.2.3 驗證試驗

考慮到實際操作的方便性，將本試驗所得最佳條件修改為麩曲培養基水分81.5%、培養時間50 h、接種量11.0%、培養溫度38℃，進行3次平行試驗，實際測得的平均愈創木酚類物質含量為3.893×10-4g/g，試驗值與理論值相近，證明應用響應面法優化細菌麩曲產愈創木酚類的培養條件是可行的。

3 結論

近年來，白酒中健康因子的研究成為越來越多科研工作者研究的熱點。研究表明，愈創木酚類物質是良好的自由基清除劑，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧和預防心血管等多種疾病的發生，具有預防疾病、抗衰老、促進人體健康的作用。試驗通過單因素試驗分析了麩曲培養基水分含量、培養時間、接種量和培養溫度對愈創木酚類物質含量的影響，并結合Box-Behnken設計及響應面分析，建立了二次多項式模型，并經顯著性檢驗證明了該模型具有可靠性。所得最佳培養條件為麩曲培養基水分81.5%、培養時間50 h、接種量11.0%、培養溫度38℃，在此條件下，愈創木酚類物質含量為3.893×10-4g/g。通過優化細菌麩曲制作工藝，探索各條件對麩曲制作的影響，為細菌麩曲應用于白酒釀造行業提供一定的數據參考。